目前, 星状病毒科包括哺乳动物属和禽类属。哺乳动物属由感染哺乳动物的病毒组成, 根据宿主的不同分为HAstV、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒、貂星状病毒; 禽类星状病毒包括火鸡星状病毒、鸟肾炎病毒^[1]。

2008年 Finkbeiner等^[2]利用宏基因组学的方法, 对澳大利亚墨尔本皇家儿童医院1999年采集的来自1名3岁患急性腹泻男童的粪便标本进行回顾检测, 发现1株与已知哺乳星状病毒属序列差异很大的星状病毒, 被暂时称为Astrovirus MBL1(AstV-MBL1)^[3]。2009年, AstV-MBL2、AstV-VA1^[4]、AstV-VA2、AstV-VA3相继在北美、印度^[5]被发现存在于散发或暴发的腹泻儿童粪便标本中, 从此引发可感染人类的其他哺乳星状病毒属的研究。

HAstV引起人类尤其是5岁以下儿童发生腹泻, 与轮状病毒、诺如病毒、杯状病毒、肠道腺病毒、沙波病毒成为病毒性腹泻的主要病原体。1997年Noel等^[6]将HAstV分为7个基因型, 并且证明这7个基因型与血清型的划分是一致的。随后, 各地又报道了血清型8(HAstV-8)的发现^{[7, 8]}。

HAstV是无包膜的单股正链RNA病毒, 基因组从 5'端到 3' 端包括一个约 85 个核苷酸的 5' 非编码区、3个开放读码框架(ORF1a、ORF1b、ORF2)、1个约80个核苷酸的 3'非编码区和1个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白, ORF1a 编码丝氨酸蛋白酶, 且其下游存在1个核定位信号; ORF1b编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP), RDRP 是通过核糖体读框移位机制合成的1个融合蛋白。HAstV衣壳蛋白由ORF2编码合成。在病毒复制的过程中, 所感染的细胞内可检测出2种病毒特异性的RNA, 1个是6.8 kb的全长基因组RNA, 另1个是2.8 kb的亚基因组RNA, 2种RNA的3'端均具有多聚腺苷酸尾。亚基因组RNA 包含了全部的ORF2序列, 可作为mRNA 表达衣壳蛋白。ORF2 编码产物至少包括2个区域:第1个区域(1415个氨基酸)在各血清型之间是高度保守的; 第2个区域(416个氨基酸结束)是高度变异的, 病毒的中和抗原决定簇即在此区域内^[9]。

星状病毒发现的最初10年里, 主要用电镜进行观察检测, 因仅有10%的星状病毒具有典型的星形外观, 故敏感性较低且无法进一步分型。随着免疫学方法在实验室诊断中的应用, 出现免疫电镜法(GEM)、放射免疫法(RIA)、免疫荧光法(QFA)、酶免疫法(EIA)等, 利用种特异或型特异性抗体可检测出HAstV 8个血清型, 还可使用不同血清型的完整病毒或基因工程法制备部分衣壳蛋白进行血清流行病学研究。

近年来, 针对病毒的流行病学研究均以分子生物学方法为手段。我国从2000年起, 北京、郑州、兰州、长春等地开始有急性腹泻的儿童星状病毒的分子流行病学调查报道^{[10, 11]}, 到目前为止发现HAstV-1、HAstV-3、HAstV-4、 HAstV-5和HAstV-8流行, 患病率与亚洲其他地区报道相似, 约为2%10%左右。感染主要集中在10月至次年1月, 与轮状病毒的流行季节相似。

分子生物学检测方法结合不同的分型方法提供与病毒血清型、基因型相关的致病性、临床表现、流行病学等信息, 使研究者对HAstV的生物学特性、流行特点、致病机制等有深层次认识。

鉴别HAstV属可使用高灵敏的引物扩增病毒基因组的保守区域, 即编码ORF1a、ORF1b非结构蛋白区和非编码区。然而, 有的学者使用来自衣壳蛋白编码区的引物, 虽然敏感性会降低, 但可以同时得到基因型别的信息。根据ORF2 5'端或3'端核苷酸的可变性, HAstV属可分为与血清型相对应的8个基因型。2种常用试验策略用于基因分型:其一, 使用针对8个基因型的共同引物扩增后相应片段测序; 其二, 分别使用针对每个型别的特异引物根据扩增产物的大小确定。

除了常用的分型方法, 根据ORF1a的遗传多样性, HAstV还可被分为2种基因型:基因型A和基因型B。基因型A包括血清型15、8, 基因型B包括血清型6、7, 但这种分类法与序列可变性和血清型不存在完全的对应关系。取而代之的是依据靠近ORF1a编码的非结构蛋白 C端高变区的分型, 在此区存在核苷酸的高频率插入和缺失, 其与病毒RNA复制、生长特性、病理表型存在一定的关系, 通过进一步研究其表型和序列变化的关系, 可促进针对病毒毒力的不同分型方法的研究^[12]。

1.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 1995年Noel 等通过对编码衣壳蛋白基因— — ORF2 测序发现一段384 bp区域, 这段区域在相同血清型的HAstV中是相同的, 但在不同血清型的毒株间是不同的, 从此研究者开始用RT-PCR的方法对HAstV进行分型。

以荧光探针应用为特点的实时PCR出现后, 使用RT-PCR检测HAstV属/基因型的检测技术又有了新的发展。Beuret等^[13]使用多重实时逆转录PCR[RT-PCR(RT2-PCR)], 利用罗氏公司的LightCycler和相应的 SYBR Green荧光染料, 同时检测诺如病毒Ⅰ 、Ⅱ 型, 肠道病毒, HAstV 3种病毒, 并且将检测时间缩短到3 h。随着人们对定量PCR和荧光探针的进一步研究, 近2年也有报道利用 RT2-PCR 定量检测样本中HAstV载量, 如Le Cann等^[14]首次利用引物AV1、AV2逆转录3'端90个核苷酸序列后使用Fam-Tamra标记探针进行实时PCR, 定量检测出污水中的HAstV载量。之后, Zhang等^[15]利用相同方法, 研究粪便中HAstV血清型和病毒载量与临床症状间的关系。定量RT2-PCR相比较传统的RT-PCR有许多优点, 包括PCR反应完成后无需经过其他反应即可进行病毒载量定量, 可以实时监测PCR过程, 可减少RT-PCR反应中的污染, 敏感性高等。有些报道称RT2-PCR比传统RT-PCR敏感性高出10100倍, 可能由于传统RT-PCR扩增的序列超过RT2-PCR, 且使用不同的引物序列, 因此导致这2种方法的效率不同^[16]。值得我们注意的是, 在设计RT2-PCR扩增片段长度时应控制在50150个核苷酸内, 否则就会出现RT2-PCR的敏感性不如传统RT-PCR的结果。

在不断的应用中, 人们发现RT-PCR的高敏感性会由于在样本中存在非特异性的抑制物而严重降低, 这些很难在RNA的抽提和纯化过程中去除的小相对分子质量抑制物大大影响逆转录酶和/或Taq多聚酶活性。Traore等^[17]在蚌类水产品前处理中尝试4种抽提试剂和3种浓缩试剂不同组合, 最终发现使用硼酸盐抽提联合有机絮凝剂或聚乙二醇(PEG)6000浓缩等方法可减小样本中抑制物对RT-PCR敏感性的影响。

2.基因芯片(gene chip) 基因芯片又称DNA微阵列(DNA microarray)或 DNA微阵列芯片, 是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针, 有规律地排列固定于支持物上, 然后与待测的标记样本的基因按碱基配对原理进行杂交, 再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描, 并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测, 从而迅速得出所要的信息。

2006年Jä ä skelä inen等^[18]用芯片检测诺如病毒Ⅰ 、Ⅱ 型及其基因亚型和HAstV1HAstV5。他们使用对不同基因型病毒特异片段识别的引物作为探针, 试验步骤包括首先多重RT-PCR扩增相应片段, 对于HAstV使用MON269 、MON270扩增ORF2区内的449个核苷酸后获得dsDNA, 再体外转录获得ssRNA后与芯片上的基因型特异引物探针杂交孵育, 最后加入逆转录酶和荧光标记的核苷酸进行引物延伸反应, 使结合并反应的探针标记上荧光信号。这个方法需要多步操作, 但可放大用于杂交的RNA模板, 因此可增加芯片的敏感性。

2008年Brown等^[19]根据单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)检测芯片的思路, 针对HAstV的8个血清型ORF1b区部分片段的保守和高变区设计一系列长度为17个核苷酸的探针用于基因分型。来自于ORF1b区部分片段的3个高变区序列的探针代表了8个基因型的不同遗传特征, 因此可用于不同基因型的区分。试验包括使用 5'端经Cy3标记的反义引物, 一步法RT-PCR扩增ORF1b区部分序列, 再按SNP芯片单链DNA操作程序获得单链DNA, 即RT-PCR产物经链特异性酶消化后, Cy3荧光标记并保护的单链DNA被留下并层析纯化。将此单链DNA与芯片上的探针杂交并检测。此方法直接标记RT-PCR的扩增产物, 无需第2步扩增标记。虽然探针与目标序列的结合并不是都很牢固, 但根据3个ORF1b区部分片段的3个高变区信号的综合分析还是能将HAstV的8个基因型成功区分的。

3.核酸序列依赖扩增技术(nucleic acid sequence based amplification , NASBA) NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异的对单链RNA进行恒温扩增的过程, 在42 ℃条件下2 h左右可将模板RNA扩增约10⁹10¹²倍。NASBA用于轮状病毒、人巨细胞病毒、鼻病毒、Epstein-Barr病毒、西尼罗河病毒皆有报道^[20]。NASBA与RT-PCR相比有一定优越性, 由于NASBA每轮循环以指数扩增而 PCR 以2ⁿ数增长, 因此NASBA达到相同拷贝数的时间要远远短于PCR。在NASBA中不存在DNA变性的步骤, 因此基因组和前病毒的DNA污染不会发生。但其也有局限, 如不能用温度控制反应的循环数、扩增产物无法直接测序等。Tai等^[21]首次利用NASBA扩增粪便样本中的HAstV后, 分别使用脂质体条带法和电化学发光法分析扩增产物, 试验同时与RT-PCR联合液相杂交法(LHA)比较, 敏感性上未见明显差异, 但NASBA结合脂质体条带法检测所需设备简单、时间短, 能适合快速筛查和现场检测。

由于分子生物学方法在流行病学研究中的广泛应用, HAstV作为病毒性腹泻的重要致病原越来越受到重视。运用分子诊断方法提高检测敏感性、特异性, 探索病毒分型与流行特征、临床症状的关系是流行病研究必不可少的手段, 血清型和基因型的不同检测方法为我们进一步研究HAstV在人群中的流行提供了重要信息, 使我们不但可以分析其遗传多样性, 还可以检测可能出现的突发重组株。相信其致病机制、免疫应答、疫苗研制、抗病毒药物会随着相关研究的增多而被人们所认识和开发。同时, AstV-MBL、AstV-VA等与HAstV具有一定氨基酸同源性的“ 新型HAstV” , 其分类有待进一步确定。随着检测技术的提高和研究的深入, 还会有更多新亚型和基因型被发现, 从而为病毒性腹泻的防治提供科学依据。