引用本文
陈宁, 傅毅, 应雅韵, 倪培华. NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与脑梗死的关系. 2011, 26(3): 175-179
CHEN Ning, FU Yi, YING Yayun, NI Peihua. Correlation between NAD(P)H oxidase p22phox C242T polymorphism and cerebral infarction. Labratory Medicine, 2011, 26(3): 175-179  
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NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与脑梗死的关系
陈宁1, 傅毅2, 应雅韵1, 倪培华1
1.上海交通大学医学院瑞金医院检验系, 上海 200025
2. 上海交通大学医学院瑞金医院神经内科, 上海 200025

作者简介:陈宁,女,1986年生,学士,技师,主要从事分子生物学和生化检验工作。

通讯作者:倪培华,电话:021-64370045-610505。

摘要
目的

了解上海地区汉族脑梗死患者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶[NAD(P)H氧化酶]p22phox亚基C242T基因多态性和等位基因频率的分布情况,探讨其多态性与脑梗死的关系。

方法

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),对176例脑梗死患者和131名健康老年人的C242T位点进行基因分型,计算等位基因的频率分布。

结果

脑梗死患者血清三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖浓度和血压与老年健康对照组之间差异具有统计学意义( P<0.05)。脑梗死组与老年健康对照组的CC、CT、TT基因型频率分别为92.05%、7.95%、0与93.89%、5.34%、0.76%;C、T等位基因频率分别为96.02%、3.98%与96.56%、3.44%,2组间的差异均无统计学意义( P>0.05)。

结论

p22phox亚基C242T位点的单核苷酸多态性与脑梗死的发生可能无关。

关键词: NAD(P)H氧化酶; 基因多态性; 脑梗死
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)03-0175-05
Correlation between NAD(P)H oxidase p22phox C242T polymorphism and cerebral infarction
CHEN Ning1, FU Yi2, YING Yayun1, NI Peihua1
1. Faculty of Medical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine ,Shanghai 200025,China
2. Department of Neurology, Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To investigate the distribution of the gene polymorphism and allele frequency of the NAD(P)H oxidase p22phox C242T, and evaluate the relationship between the polymorphism and cerebral infarction among Han population in Shanghai.

Methods

The gene C242T was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique in 176 cerebral infarction patients and 131 healthy elders. The frequency distribution of allele was calculated.

Results

The serum triglyeride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), blood glucose level and blood pressure in cerebral infarction patients were much higher than those in the healthy elders ( P<0.05). However, the genotype distributions of the cerebral infarction patients were 92.05% (CC), 7.95% (CT) and 0(TT). The genotype distributions of the healthy elders were 93.89% (CC), 5.34% (CT) and 0.76% (TT). The allele frequency in the cerebral infarction patients was distributed as 96.02%(C) and 3.98% (T), while that in the healthy elders was distributed as 96.56% (C) and 3.44% (T). There was no significant difference in genotype and allele frequency distribution between the cerebral infarction patients and the healthy elders( P>0.05).

Conclusions

The NAD(P)H oxidase p22phox C242T polymorphism might not associate with cerebral infarction.

Keyword: NAD(P)H oxidase; Gene polymorphism; Cerebral infarction
引言

脑梗死(cerebral Infarction, CI)是指局部脑组织因血液循环障碍, 缺血、缺氧而发生的软化坏死。一般认为, CI的危险因素有高脂血症、高血压病、糖尿病及烟酒等不良嗜好, 但临床发现许多CI患者并不存在上述的危险因素。随着分子生物学和大量流行病学的深入研究, 显示CI的发生有可能与患者特定的基因多态性有关。现代的研究普遍认为CI的发病机制有可能是遗传易感性与多种环境因素的相互作用所致[1, 2]。近年来, 国内外针对基因多态性与CI相关性的科研取得了很大的突破, 但是普遍存在着结论不一致的现象[2, 3]。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NAD(P)H]是中性粒细胞和血管系统中活性氧的主要来源, 在缺血性损伤和动脉粥样硬化形成中发挥着重要作用[4]。而p22phox是其中一个重要的亚基, 对于氧化酶产生氧自由基发挥关键作用, 其基因多态性倍受关注[5]。本实验采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)等技术对176例CI患者和131名健康老年人进行研究, 探讨上海地区汉族人群NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与CI发病的关系, 以揭示CI患病易感性基因学的异常。

材料和方法
一、材料

1、研究对象

CI患者176例, 男98例, 女78例, 年龄42~80岁, 平均(65.0± 9.4)岁, 选自2002年8月~2009年10月在上海交通大学医学院附属瑞金医院及上海市闵行区中心医院神经内科因CI住院的患者, 符合1995年第4届全国脑血管病学术会议修订的急性CI的诊断标准, 无短暂性脑缺血发作, 并经头颅电子计算机断层扫描(CT)和(或)磁共振成像(MRI)检查确诊。健康老年对照组131名, 男61名, 女70名, 年龄46~80岁, 平均(62.0± 9.1)岁, 为门诊老年体检者, 均无心脑血管疾病史。入选实验对象均为上海地区汉族人, 彼此之间无血缘关系, 无阳性家族史; 同时测量血压。所有入选对象至少1个月内未使用相关药物。

2、试剂

dNTP、Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司; DNA Marker DL 2000购自大连宝生物科技公司; UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒、Rsa I限制性内切酶购自上海生工生物工程服务有限公司; 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; 其他试剂均为国产分析纯。

3、仪器

PTC200型PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司); PicoFugeⅡ 微型台式离心机(德国Stratagene公司); Bio- Photometer紫外分光光度计(德国Eppendorf公司); 多功能水平电泳槽、垂直电泳槽、Tanon EPS 100电泳仪、Tanon GIS 2010凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

二、方法

1、标本采集

所有被检者均禁食12~14 h, 采空腹静脉血5 mL, 血样经乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝处理后, 置于-80℃备用。其中2 mL用作DNA提取, 另3 mL静脉血分离血清作三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血糖测定。

2、血基因组DNA的提取

取抗凝全血200 μ L, 按UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒说明书提取基因组DNA, 并行紫外分光光度计比色定量及纯度鉴定。

3、引物序列

根据基因库号NG_007291自行设计1对扩增C242T基因的引物, 上游引物5'-TGCTTGTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3'(9063-9088), 下游引物5'-AACACTGAGGTAAGTGGGG-GTGGCTCCTGT-3'(9410-9381)。

4、PCR扩增

PCR反应总体积为25 μ L, 其中包含10× PCR缓冲液2.5 μ L, 25 mmol/L dNTP 0.2 μ L, 50 μ mol/L上游引物、下游引物各0.2 μ L, DNA 200 ng, Taq DNA聚合酶1 U, 用去离子蒸馏水补至25 μ L。扩增循环参数:94 ℃ 预变性5 min, 再按94 ℃变性 40 s、60 ℃退火 40 s、72 ℃延伸 90 s共35次循环, 最后72 ℃ 扩增延伸5 min。

5、基因型的判断

5 μ L PCR产物用10 U Rsa Ⅰ 限制性内切酶在恒温箱中37℃酶切水浴过夜。取5 μ L酶切产物进行加样, 行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 100 V电泳80 min, 经0.1% AgNO3染色, 400 μ L甲醛和100 mL 1.5%NaOH混合显色, 直至DNA条带清晰显现为止, 拍照观察结果。

6、PCR产物核苷酸序列测定

随机选取各基因野生型、杂合子、突变纯合子各2例的PCR产物, 由上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。

三、统计学方法

等位基因频率=(纯合子例数× 2+杂合子例数)/(2× 总例数)。全部统计数据用SPSS16.0统计软件进行统计。用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本的群体代表性。计量资料的数据描述用 ± s表示, 组间比较使用t检验; 计数资料的组间比较采用卡方检验。当P< 0.05时, 表明2组之间的差异有统计学意义。

结果
一、NAD(P)H氧化酶C242T多态性电泳图谱

PCR产物条带的大小为348bp。CC型只有在348bp处出现条带。若有C→ T的突变时, 产生Rsa Ⅰ 内切酶的识别位点, 则可在188bp和160bp处出现条带。因此, TT型的样本会有2条条带出现, 分别位于188bp和160bp; 而CT型则有3个片段大小条带, 分别为348bp、188bp和160bp。见图1。

图1 C242T位点PCR产物RFLP的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果注:M:DL2000 DNA Marker; 1:TT型; 2、3:CC型; 4:CT型

二、NAD(P)H氧化酶C242T基因型电泳图谱和多态性序列分析

采用上游引物对PCR-RFLP显示的CC、CT和TT型产物进行序列分析以验证PCR-RFLP结果, 见图2至图4。

图2 C242T位点CC型基因测序结果图

图3 C242T位点CT型基因测序结果图

图4 C242T位点TT型基因测序结果图

三、CI组和健康老年对照组一般项目的比较

CI患者血清TG、HDL-C、LDL-C、血糖浓度和血压与健康老年人对照组间的差异均有统计学意义(P< 0.05), 而2组之间年龄和TC浓度差异无统计学意义(P> 0.05), 见表1。

表1 CI组和健康老年对照组一般项目的比较
四、不同研究对象NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因型和等位基因的比较

Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示, 本研究群体在各基因位点上的分布频率均符合遗传平衡, 具有群体代表性。CI组的基因型和等位基因频率分布与健康老年对照组相比, 两者之间差异均无统计学意义(P> 0.05), 见表2。

表2 CI组和健康老年对照组C242T基因多态性分布
讨论

NAD(P)H氧化酶是由5个主要亚基构成的酶复合体[6]。当细胞处于静止期时, p40phox、p47phox和p67phox亚基以复合体的形式存在于细胞液中, p22phox和gp91phox位于细胞膜上, 二者相互结合形成1个异二聚体即细胞色素b558。在主动脉粥样硬化斑块的内膜平滑肌细胞和巨噬细胞中, 有NAD(P)H氧化酶各种亚基的表达, 干扰素-γ 和转化生长因子-β 可使这些亚基的表达增强[7]。编码基因位于染色体16q24, 长约8.5 kb, 由6个外显子和5个内含子组成[8]。p22phox亚基基因多态性位点约有10种, 其中, 目前已经被认为比较重要的有p22phox基因启动子区的-A930G、编码基因第4外显子的 C242T和编码基因第6外显子的A640G等位点的多态性改变。

本研究结果显示, CI患者血清TG、HDL-C、LDL-C、血糖浓度和血压与健康老年人之间差异具有统计学意义(P< 0.05), 证实高脂血症、高血糖和高血压与CI确实有关。同时, C242T多态性可导致p22phox亚基第72位组氨酸被酪氨酸替代, 该部位是2个潜在的血红蛋白结合位点之一。Hayaishi-Okano等[9]对日本人群中2型糖尿病患者NAD(P)H氧化酶p22phox多态性与颈动脉粥样硬化的关系进行了研究, 指出p22phoxC242T位点的C→ T突变能够加快2型糖尿病患者无症状性动脉粥样硬化的发展, 同时对非糖尿病患者具有激发胰岛素抑制的作用。

此次研究旨在国内报道关于NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T位点多态性和CI关系的探究结果。我们分析了上海汉族人群176例CI患者和131名健康老年人中这一基因的多态性结果表明, CI组的基因型和等位基因频率分布与健康老年对照组相比, 差异均无统计学意义(P> 0.05)。C242T基因可能不是CI的一个危险因素, 这与韩红星等[3]的研究结果相反。同样, Spence等[10]对爱尔兰人群中来自388个家庭的1 023例患者进行连锁性分析后, 提出C242T的多态性改变与心血管疾病中的缺血性心脏病之间并未找到任何关联。

综上所述, CI是多基因、多因素的疾病。目前国内外研究结论不一致可能是一些以下原因造成的:样本量、实验设计、技术和方法学的不同; CI的分类诊断标准不同、未排除混杂因素的影响、对病例的选择是否符合Hardy - Weinberg遗传平衡定律、人群分布及种族差异。因此, 为了探索NAD(P)H氧化酶p22phoxC242T基因多态性是否参与CI的发病, 这需要我们开展更多大样本的临床研究和综合考虑氧化酶等其他基因位点的多种因素。

The authors have declared that no competing interests exist.

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