引用本文
曹丹如, 陈悦, 邵维杰, 王庆忠, 马建伟, 陶义训. 检测粪便隐血的金免疫渗滤法的初步研究. 2011, 26(3): 153-155
CAO Danru, CHEN Yue, SHAO Weijie, WANG Qingzhong, MA Jianwei, TAO Yixun. Preliminary study of a gold immunofiltration assay for the faecal occult blood. Labratory Medicine, 2011, 26(3): 153-155  
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检测粪便隐血的金免疫渗滤法的初步研究
曹丹如1, 陈悦1, 邵维杰1, 王庆忠1, 马建伟2, 陶义训1
1. 上海市临床检验中心,上海 200126
2. 同济大学附属东方医院,上海 200120

作者简介:曹丹如,女,1961年生,学士,副主任技师,主要从事免疫学检验研究。

基金:上海市卫生局局级课题(2008193);上海市科委项目(09DZ1907100)
摘要
目的

建立以人白蛋白为靶抗原的检测人粪便隐血的金免疫渗滤法试剂,并作临床初步应用。

方法

应用自制的2株抗人白蛋白单克隆抗体,其中1株包被在硝酸纤维素膜上,另1株与胶体金结合,组成金免疫渗滤试剂,并用研制的试剂与商品化便隐血免疫层析法试剂对比检测69例临床粪便标本。

结果

本研究建立的方法检测范围为1010 000 mg/L,与免疫层析法试剂条临床比对结果显示,69例标本中除1例本法为(+),而免疫层析法为(-)外,其余全部符合。

结论

本研究研制的金免疫渗滤法粪便隐血试验方法简便、结果可靠,进一步研究后可应用于临床。

关键词: 金免疫渗滤法; 白蛋白; 粪便隐血试验
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)03-0153-03
Preliminary study of a gold immunofiltration assay for the faecal occult blood
CAO Danru1, CHEN Yue1, SHAO Weijie1, WANG Qingzhong1, MA Jianwei2, TAO Yixun1
1. Shanghai Center for Clinical Laboratory,Shanghai 200126,China
2. Shanghai East Hospital,Tongji University, Shanghai 200120,China
Abstract
Objective

To develop a gold immunofiltration assay reagent for the detection of albumin in faeces as an occult blood test, and carry out a preliminary clinical trial.

Methods

The gold immunofiltration assay reagent was prepared with 2 self-prepared anti-human-albumin monoclonal antibodies, one of which was immobilized on the nitrocellulose membrane and the other was labeled with colloidal gold. 69 clinical faecal samples were tested by the reagent and a commercial faecal occult blood test reagent strip comparatively.

Results

The results showed that the determination range of gold immunofiltration assay was 10-10 000 mg/L. The simultaneous determination of 69 clinical faecal samples by gold immunofiltration assay and commercial faecal occult blood test reagent strip showed coincidence except 1 sample.

Conclusions

The prepared gold immunofiltration assay reagent for faecal occult blood test is simple , rapid and suitable for clinical application after further study.

Keyword: Gold immunofiltration assay; Albumin; Faecal occult blood test
引言

结直肠癌在世界范围内的发病率已高居第3位[1], 并呈现逐渐上升趋势。最近有资料显示, 上海市区居民1973至2005年男女性结直肠癌发病率也均呈上升趋势[2]。检测血红蛋白的免疫层析法粪便隐血试验是目前最常用方法, 但因方法的敏感性不足或因标本中血红蛋白的浓度过高可出现假阴性反应。因此有建议改用检测粪便中的转铁蛋白、白蛋白等以提高粪便隐血试验的敏感性[3, 4]。我们曾建立检测尿微量白蛋白的金免疫层析法[5], 本研究将该法改进, 使之适用于检测粪便中的白蛋白, 并作了初步临床试验。

材料和方法
一、材料

1.抗人白蛋白单克隆抗体

2株抗白蛋白单克隆抗体2E4和1F5腹水由本实验室自制[5], 用辛酸法从腹水中纯化IgG, 1F5用于胶体金标记, 2E4用于包被固相载体。

2.0.45 μ m硝酸纤维素微孔滤膜

英国Amersham Life Science产品。

3.临床试验粪便标本

69例粪便标本从同济大学附属东方医院收集。

4.粪便标本处理

取约1 g的标本放入装有2 mL pH值7.4的0.02 mol/L Tris-HCl溶液(含0.13 mol/L NaCl)的Diasys粪沉渣分离管中, 摇匀, 4 000 r/min(离心半径为10 cm)离心, 取上清液即为粪便标本液。

5.便隐血双联法检测试纸

由万华普曼生物工程有限公司生产, 批号为80802001, 是用免疫法及化学法结合的试纸条。免疫法部分是测定粪便中血红蛋白的胶体金双抗体夹心层析技术。

二、方法

1.金免疫渗滤法测定粪便中白蛋白

(1)试剂:金免疫渗滤装置制备方法见文献[5], 不同之处是在硝酸纤维素膜上有2个包被点, 一个是测试点(T), 含有抗人白蛋白单抗2E4; 一个是质控点(C), 含有测定时显色相当于浓度10 mg/L的人白蛋白, 见图1。在测定孔上方放一滤纸过滤器。胶体金结合物溶液为抗人白蛋白单抗1F5与胶体金的结合物。洗涤液为pH值7.4的0.02 mol/L Tris-HCl、0.05%Tween-20、0.13 mol/L NaCl溶液; (2)测定步骤:先在金免疫渗滤装置孔中加入粪便标本液200 μ L, 待完全渗入后, 取下过滤器。加入洗涤液200 μ L, 待完全渗入。加入胶体金结合物溶液200 μ L, 待完全渗入。加入洗涤液200 μ L, 待完全渗入; (3)结果观察:质控点(C)应有清晰的红色斑点出现。测试点(T)有红色斑点出现, 为阳性; 无红色斑点出现, 为阴性。

图1 金免疫渗滤装置

2.对比试验

所有标本均用万华普曼公司便隐血双联法检测试纸作对比检测。

结果
一、半定量金免疫渗滤法试验条件和性能评价

1.最适工作条件的选择

经试验测定, 测试点(T)上纯化后的单抗2E4的最佳点样浓度为2.0 mg/mL, 单抗1F5的胶体金结合物最佳加样量为200 μ L。

2.敏感性

在正常人粪便标本液中加入不同浓度的人白蛋白标准溶液, 按测定步骤进行测定, 观察测试点(T)红色斑点的颜色, 结果见表1。从表1可看出, 人白蛋白浓度10 mg/L为阳性临界值, 最高测定范围可达10 000 mg/L。

表1 不同白蛋白含量的粪便标本液测定结果

3.重复性

配制人白蛋白含量分别为300和10 mg/L的粪便标本液, 按测定步骤进行测定, 各测定20次。2种白蛋白浓度的标本显色深度均一, 高浓度标本显色明显深于低浓度标本, 说明结果重复性符合要求。

4.稳定性试验

将试剂盒放在37 ℃恒温箱中, 时间为11 d。配制人白蛋白浓度为300、100、10 mg/L的标本液, 按测定步骤进行测定, 每3~4天测定1次, 共测定4次, 每次每个浓度各测定3次, 与保存于4 ℃的试剂盒做比较, 观察测试点(T)和定量质控点(C)红色斑点颜色的深浅, 结果两者无差别。

二、初步临床对比试验

用本研究制备的白蛋白金免疫渗滤法试剂与万华普曼的血红蛋白金免疫层析法试纸对比检测了69例粪便标本, 除1例本法(+)而万华普曼试剂为(-)外, 其余68例中, 59例(-)、9例(+), 全部符合。

讨论

粪便隐血试验是诊断消化道出血尤其是隐性出血的一种检测方法。传统的隐血试验是针对血红蛋白设计的简易化学试验, 该法价廉、简便, 但特异性差, 敏感性较低, 易受某些食物等因素的干扰而影响其检测效果。近年来, 免疫学方法配以金标技术的应用提高了检测的特异性和敏感性, 检测血红蛋白的金免疫层析试条已用于粪便隐血试验, 但阳性检出率偏低[6], 约有40%50%的上消化道出血和部分下消化道出血不能检出。其原因有:一为上消化道出血时血红蛋白经过消化酶的降解而失去抗原性, 致测定血红蛋白的免疫层析法结果为阴性, 因此一般同时用化学法作补充测定。另一原因是出血量大时, 过量的血红蛋白导致免疫层析法产生钩状效应, 使得结果呈现阴性。有报道用检测粪便中的白蛋白、转铁蛋白等血液中的蛋白成分作为粪便隐血的标志[3, 4]。现在我们用金免疫渗滤法检测粪便中的白蛋白, 除改变了检测对象可能提高敏感性外, 特别要提出的是, 免疫层析法是一步法, 检测的抗原过剩时会出现钩状效应而出现假阴性, 而免疫渗滤试验是两步法, 加入抗原标本与固相抗体反应, 经过洗涤除去剩余的抗原后再加入金标抗体进行反应, 因此不会发生抗原过剩的钩状效应。我们的试验结果表明, 加入的白蛋白达10 000 mg/L时, 仍出现阳性反应。本法如果与我们正在研发的纸片化学法[7](测定粪便中的血红蛋白)联合起来一起检测, 更可提高粪便隐血的阳性检出率。通过进一步的研究和临床试验, 这种联合检测可能成为消化道恶性肿瘤筛查的一个简便、有效的方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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