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刘伟平, 高秀峰. 尿中磺酸化胆汁酸及其检测方法的研究进展. 2011, 26(2): 139-141
  
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尿中磺酸化胆汁酸及其检测方法的研究进展
刘伟平1, 高秀峰2
1.自贡市第一人民医院检验科,四川 自贡 643000
2.四川大学华西基础医学与法医学院生化与分子生物学教研室,四川 成都 610041

作者简介:刘伟平,男,1980年生,硕士,技师,主要从事生化与分子生物学检验方法研究。

摘要

磺酸化胆汁酸(sulfated bile acids, SBA)是胆汁酸中的一类,是硫酸分子的磺酸基与胆汁酸类固醇骨核的C3位发生结合反应而生成的磺酸酯。胆汁酸发生硫酸结合反应是机体的一种解毒机制,在人体胆汁酸代谢过程中具有重要的意义[1]。我们综述了尿SBA的形成机制、临床意义以及检测方法的研究进展。

关键词: 磺酸化胆汁酸; 尿液; 肝胆疾病
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)02-0139-03
一、尿SBA的形成机制

在机体正常生理状况下, 胆汁酸主要存在于肠肝循环中, 尿中含量极低(≤ 7.0 μ mol/L)[2]。当出现如急、慢性肝炎、胆汁淤积、非代偿性肝硬化、肝癌等肝胆疾病时, 血中胆汁酸浓度显著升高。其具体机制为:肝细胞受损时可引起胆汁酸合成及排泄障碍。肝细胞内胆固醇7α -羟化酶及12α -羟化酶活力降低, 胆酸的合成明显减少, 血中三羟胆酸/二羟胆酸比值下降。肝细胞摄取胆汁酸的功能障碍, 使胆汁酸从血中的清除速率减慢, 导致血中胆汁酸的浓度升高。此时, 作为机体的一种解毒机制和自身防御机制, 大部分胆汁酸即与硫酸分子发生结合反应, 生成SBA。SBA具有较强的水溶性, 很容易经肾脏代谢而排出[3]。研究表明, 各种肝胆疾病患者尿中SBA浓度表现为急剧升高, 大约10.0100.0 μ mol/L[4]。

二、尿SBA检测的临床意义

正常人体尿SBA含量极微量。肝胆疾病患者血中胆汁酸浓度明显升高, 导致尿SBA的排泄量显著增加。尿SBA的浓度与肝胆系统疾病密切相关, 急性肝炎、肝硬化、胆汁淤积患者尿SBA的浓度显著增加[5, 6]。Tazuke等[7] 测定了38例健康人及102例肝胆疾病患者尿SBA含量, 发现健康人尿SBA的浓度低于10.0 μ mol/g Cr, 肝胆系统疾病患者明显高于此值。Baba等[8] 测定了323例各种肝胆系统疾病患者的尿SBA的含量, 急性肝炎、肝外胆汁淤积、肝内胆汁淤积等疾病患者尿SBA浓度增高最为显著, 其他疾病患者尿SBA增高程度, 按从高到低排列依次为肝硬化非代偿期、肝癌、肝硬化代偿期、慢性活动性肝炎。Nanashima等[9]的研究表明尿SBA水平与血清总胆汁酸、总胆红素、透明质酸水平呈显著正相关。

以往的研究资料表明, 尿SBA浓度与各种急性、慢性肝胆系统疾病密切相关。因此, SBA是肝胆系统疾病的诊断、监测和预后观察的一项新的灵敏指标。

三、尿SBA的检测方法

迄今为止, 尿SBA的主要检测方法有高效液相色谱(HPLC)、酶比色分析法、流动注射-固定化酶-化学发光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和电极法。

1. HPLC法

Goto等[10]开发了HPLC-紫外可见分光光度法。1986年, Amakasu等[11]开发了一种HPLC-荧光分光光度法用于尿SBA的测定, 该方法较分光光度法具有更高的灵敏度。Nichols等[12]建立了反相HPLC, 可实现快速分离尿SBA。反相HPLC简化了HPLC的样本预处理过程, 减少了衍生化和水解步骤。但由于HPLC法需要样本预处理而不能广泛用于临床常规分析。

2.酶比色分析法

1992年, Tazuke等[7]首次开发了一种基于酶法测定尿SBA的酶比色分析法。该法测定的基本原理为:SBA在胆汁酸磺酸酯酶(bile acid sulfate sulfatase, BSS)催化作用下发生水解而脱去磺酸基, 生成3β -羟类固醇; 后者在氧化型辅酶NAD+存在下由β -羟基类固醇脱氢酶(β -hydroxylsteroid dehydrogenase, β -HSD)催化作用下发生氧化还原反应, 其本身被氧化成3β -酮类固醇, 同时NAD+被还原成NADH; NADH在黄递酶的催化作用下使硝基蓝四唑(NTB)还原生成深蓝色化合物, 其本身又转化为NAD+, 通过测定反应体系在540 nm处的吸光度即可计算出样本中SBA的含量。该方法具有较高的灵敏度、特异性及精密度; 其线性范围为5.0200.0 μ mol/L。该方法在日本已开发成商用试剂盒, 用于临床上早期诊断和监测肝胆疾病[6, 9, 13]。

3.流动注射-固定化酶-化学发光法

1997年, Gao等[14]开发了流动注射-固定化酶-化学发光法用于尿SBA的测定。该方法测定全过程在流动注射分析仪中进行, SBA标准或样本被注入载流中并进入固定化酶反应柱, 试样在固定化BSS 催化作用下水解成β -羟基类固醇, 后者在固定化3β -HSD的催化作用下和载流中的β -NAD+反应生成β -酮类固醇; 同时β -NAD+转变为NADH, NADH又在溶解氧共存下与载流中1-甲基吩嗪二甲酯(1-MPMS)反应产生H2O2, 含有H2O2的试样带又和鲁米诺试剂汇合, 二者在过氧化物酶的催化作用下发光并进入流通池; 其发光量由光计数检测器检出。该方法SBA浓度在0.112.0 μ mol/L范围内呈良好的线性, 其相关系数(r)> 0.999。除尿酸和维生素C对化学发光有影响外, 其他物质在生理范围内对该方法并无影响。尿酸的干扰可在样本预处理时通过固相萃取柱除去, 维生素C的干扰可通过在试剂中加入抗坏血酸氧化酶而除去。该法进样量为20 μ L; 分析速度为30 tests/h; 检出限为0.1 μ mol/L, 变异系数< 2.2%, 测定范围为0.112.0 μ mol/L。该方法具有极高的灵敏度、良好的准确度和可靠性, 可实现自动化[15], 其缺点是需要特殊分析仪器。

4.ELISA法

1998年, Kobayashi等[16] 首次报道了一种识别胆汁酸衍生物的单克隆抗体, 利用制备的单克隆抗体开发了ELISA法, 用于3-硫酸熊脱氧胆酸含量的分析。该方法的线性范围为2.0200.0 pg/mL。由于单克隆抗体的特异性强, 所以干扰性极低。而且灵敏度极高, 其最小检出量为2.0 pg/mL, 但该方法不能用于测定尿SBA的总浓度。

5.电极法

2007年, Koide等[17]建立了一种测电流型的胆汁酸生物传感器(电极), 用于尿SBA的分析。电极由一个工作电极(铂), 一个对电极(铂)和一个参比电极(Ag/AgCl)构成。电极上涂布了一层Nafion膜, 能使传感片防止尿中干扰物所引起的电极反应。β -HSD、NADH氧化酶(NHO)和BSS 3种酶通过戊二醛共价交联而固定于传感片上。该法检测原理为:在胆汁酸磺酸酯酶催化作用下, SBA发生水解反应脱去磺酸基而生成β -羟类固醇, 后者在β -羟基类固醇脱氢酶的作用下与 β -NAD+反应产生NADH, NADH在氧存在下由NHO催化其发生氧化, 同时生成的H2O2发生电极反应, 根据产生的电流量定量测定SBA的浓度。磺酸化胆汁酸浓度与其电流响应值在一定范围内呈正相关。该方法测定胆汁酸的线性范围为2.0100.0 μ mol/L, 具有一定的可行性, 但由于电极法容易受到尿中共存物质的影响, 因而稳定性和重现性有待于进一步考察。

四、小结与展望

血清胆汁酸是诊断肝胆系统疾病的常用参考指标。由于检测血中胆汁酸需要静脉穿刺, 因而对患者具有一定的侵害性和损伤性。特别是对于腹泻、烧伤和儿童等抽血较困难的患者以及需要长期监测的慢性肝脏疾病患者, 无侵害无创伤的诊断指标就显得非常有价值, 测定尿SBA能克服这一缺点。大量研究资料表明, 尿SBA可作为一项新的灵敏指标用于肝胆系统疾病的诊断。目前, 在我国关于SBA的研究极少, 还未出现尿SBA的临床诊断试剂盒。开发出简便、灵敏、准确可靠的检测方法, 将是临床生化检验学科的重要课题之一。

The authors have declared that no competing interests exist.

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