操作时差对半自动中和抑制法时间分辨荧光免疫分析检测乙型肝炎病毒e抗体的影响
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莫翔. 操作时差对半自动中和抑制法时间分辨荧光免疫分析检测乙型肝炎病毒e抗体的影响. 2011, 26(2): 125-126
莫翔. Labratory Medicine, 2011, 26(2): 125-126
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莫翔. Labratory Medicine, 2011, 26(2): 125-126
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操作时差对半自动中和抑制法时间分辨荧光免疫分析检测乙型肝炎病毒e抗体的影响
作者简介:莫 翔,女,1970年生,主管技师,主要从事临床免疫学检验及质量控制工作。
摘要
目的
研究使用中和抑制法时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测乙型肝炎病毒e抗体(抗-HBe)过程中加入中和抗原的快、慢对检测结果的影响。
方法随机选择血清样本与中和抗原一起加入(时间间隔为0)时测定结果<1.5 NCU/mL(阴性)的样本按浓度范围分成7组,即0~0.2 NCU/mL 为A组、0.201~0.4 NCU/mL为B组、0.401~0.6 NCU/mL为C组、0.601~0.8 NCU/mL为D组、0.801~1.0 NCU/mL为E组、1.001~1.2 NCU/mL为F组、1.201~1.4 NCU/mL为G组,每组20例,按加入中和抗原的间隔时间5、10、15、20、30 min分别进行操作,检测的最终结果采用多个样本比较的秩和检验及多个样本间两两比较的秩和检验进行分析。
结果加入中和抗原的间隔时间超过10 min对不同浓度组的测定结果均有显著影响( P<0.05、 P<0.01),并随着间隔时间的增加而增高,且有假阳性结果增多的趋势。
结论在用中和抑制法TRFLA手工定量检测抗-HBe时,操作时差>10 min可造成测定结果的假性增高和假阳性,建议在加入血清样本后的10 min内加入中和抗原,以降低错误结果的发生率。
关键词:
乙型肝炎病毒; e抗体; 时间分辨荧光免疫分析; 操作时差; 假阳性
中图分类号:R373.2
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2011)02-0125-02
引言
时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)因其敏感性高、稳定性好, 试剂寿命长和非放射性等特点, 已经成为临床及治疗监测和基础医学研究等方面的重要手段[1]。我们在采用的中和抑制(竞争抑制)法TRFIA检测乙型肝炎病毒e抗体(抗-HBe)的实验中发现, 当样本数量较大时或加样时间过长时, 测定结果会随着加入待测血清后放置时间的延长以及后续加入中和抗原— — 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的不及时而受到明显的影响, 甚至有导致假阳性的趋势。
材料和方法
一、材料
1.样本来源
全部样本均来自南宁市第一人民医院体检人群, 静脉采血后30 min内常规分离血清置2~8 ℃冰箱保存, 1周内检测完毕。
2.仪器
上海新波生物技术有限公司生产的半自动ANYTEST 2000时间分辨荧光分析仪、Egate 2310全自动洗涤机、2510变频振荡器。
3.试剂
苏州新波生物技术有限公司生产的批号为20081110的中和抑制法TRFIA抗-HBe试剂盒, 且在有效期内使用。
二、方法
1.基础试验
将试剂盒从冰箱取出平衡至室温(20~25 ℃), 每加入1个血清样本随即加入中和抗原, 标准品亦如此; 后严格按说明书操作, 此步加样时差为0, 即无时差。
2.时差试验
随机抽取基础试验中结果< 1.5 NCU/mL的样本, 按浓度(NCU/mL)0~0.2(A组)、0.201~0.4(B组)、0.401~0.6(C组)、0.601~0.8(D组)、0.801~1.0(E组)、1.001~1.2(F组)、1.201~1.4(G组)分成7组, 每组20例, 在反应孔中加入50 μ L血清后, 分别置室温(20~25 ℃)5、10、15、20和30 min后加入中和抗原, 再按说明书操作。
3.结果判断
> 1.5 NCU/mL为阳性。
三、统计学方法
采用Excel 2003统计软件进行统计学处理, 各浓度组数据采用多个样本比较的秩和检验及多个样本间两两比较的秩和检验。
结果
所选定的各个浓度组的测定结果加样后放置10 min内再加入中和抗原对测定结果影响不大, 10 min后随加入中和抗原间隔时间的延长而明显增高, 并且阳性例数有增加的趋势, 见表1。采用多个样本比较的秩和H检验, 各浓度组内超过10 min后不同时间的测定值差异无统计学意义(P< 0.05)。
 | 表1 不同浓度组延迟加入中和抗原对抗-HBe (TRFIA法)测定结果的影响(NCU/mL) |
讨论
本研究所用方法的原理系采用多克隆抗-HBe包被反应孔, 随后加入待测样本和HBeAg中和抗原, 此时包被孔和待测样本中的抗-HBe分别与中和抗原发生竞争性结合, 当待测样本中存在抗-HBe并且浓度越高时, 包被孔(固相)中的抗-HBe与中和抗原结合就越少, 与之后加入的铕标记单克隆抗-HBe反应生成的抗-HBe-HBeAg-铕标记抗-HBe复合物越少, 荧光强度越弱。就方法的原理而言, 加入中和抗原及时与否理应不会对最终的检测结果产生影响, 试剂盒的说明书也未对此部分作出具体要求。但从上述实验结果来看, 加入血清后延迟10 min以上再加入中和抗原, 各组的测定结果会随着加入中和抗原时间的增加而明显增高, 阳性检出数也明显增多。出现这一现象的原因我们分析可能与包被固相上的多克隆抗-HBe纯度有关。多克隆抗体通常是将抗原直接免疫动物后由其血清中获得, 由于抗原通常都有许多的抗原决定簇, 故而所得的抗体亦为针对这些决定簇的抗体混合物[2]。受此因素制约, 当固相上的多克隆抗-HBe与待检血清长时间接触而未有中和抗原参与反应时, 有可能会与待检血清中的某些物质发生交叉结合反应, 使最终参与反应的多克隆抗-HBe浓度减少, 从而引起终产物减少, 荧光强度降低, 间接造成待检样本中抗-HBe浓度的假性增高。是否还存在其他因素的干扰, 有待进一步研究。
目前多数基层医院实验室采用手工完成全部操作后再用半自动时间分辨荧光免疫分析仪检测终产物的荧光强度, 这就不可避免地存在操作时差的问题, 因此用本品牌试剂检测抗-HBe时, 建议手工加入血清样本后尽量于10 min内加入中和抗原, 以确保实验结果的重复性及准确性, 并尽可能减少假阳性结果的发生。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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