线粒体DNA ND1基因T3394C点突变与2型糖尿病的关系

引用本文

黄承乐, 黄红华, 丁凯宏. 线粒体DNA ND1基因T3394C点突变与2型糖尿病的关系. 2011, 26(2): 122-124
HUANG Chengle, HUANG Honghua, DING Kaihong. Association between T3394C point mutation in the mitochondrial DNA ND1 gene and type 2 diabetes mellitus. Labratory Medicine, 2011, 26(2): 122-124 复制到剪切板

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线粒体DNA ND1基因T3394C点突变与2型糖尿病的关系

黄承乐, 黄红华, 丁凯宏

广西壮族自治区百色市人民医院,广西百色 533000

作者简介:黄承乐,男,1964年生,副主任技师,主要从事分子生物学检验工作。

摘要

目的

探讨本地区汉族人群线粒体DNA ND1基因中T3394C突变与2型糖尿病(T2DM)的关系。

方法

应用聚合酶链反应(PCR)对无血缘关系的225例T2DM患者和190名正常对照者的外周血DNA进行PCR扩增并直接测序确证。

结果

糖尿病患者组中检出T3394C突变8例(3.56%),正常对照组检出1名(0.53%),2组间比较差异有统计学意义( P<0.05)。

结论

线粒体DNA T3394C突变可能与本地区汉族人群T2DM的发生有关。

关键词: 线粒体ND1基因; 2型糖尿病; 基因突变

中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)02-0122-03

Association between T3394C point mutation in the mitochondrial DNA ND1 gene and type 2 diabetes mellitus

HUANG Chengle, HUANG Honghua, DING Kaihong

Baise City People's Hospital, Guangxi Baise 533000,China

Abstract

Objective

To study the relationship of T3394C point mutation in the mitochondrial DNA ND1 gene with type 2 diabetes mellitus(T2DM) in local Han people.

Methods

The peripheral blood DNA was amplified and sequenced in 225 T2DM patients and 190 controls by polymerase chain reaction (PCR).

Results

There were 8 cases(3.56%)of T3394C mutation in T2DM patients and 1 case(0.53%)in controls. There was significant difference between the 2 groups( P<0.05).

Conclusions

The point mutation of T3394C in mitochondrial DNA could be related to the occurrence of T2DM in local Han people.

Keyword: Mitochondrial DNA ND1 gene; Type 2 diabetes mellitus; Gene mutation

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引言

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是遗传和环境等多种因素引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病。目前, 已发现多种基因异常所致的单基因突变糖尿病, 其中以线粒体基因突变糖尿病为最多见。线粒体是细胞内储存和供给能量的场所, 细胞生命活动所需能量的90%来自线粒体。由于线粒体氧化磷酸化在胰岛β 细胞分泌胰岛素过程中起重要作用, 线粒体基因缺陷与糖尿病发生发展的关系日益受到关注。本研究测定了225例T2DM和190名正常对照的基因突变, 以阐明T3394C与本地区T2DM的关系。

材料和方法

一、材料

1.研究对象

225例糖尿病组为随机选取的本地区汉族人, 根据1997年世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断标准确诊为T2DM的住院患者225例, 其中男101例, 女124例, 年龄(58.6± 9.1)岁, 患者间无亲缘关系; 正常对照组为健康体检者190名, 其中男93名, 女97名, 年龄(54.2± 6.8)岁, 无糖尿病及家族史。2组间性别、年龄和体重指数差异无统计学意义。

2. 主要仪器和试剂

主要仪器: Rotor-Gene-30000 PCR扩增仪为澳大利亚Gene公司产品; DiaSTAT分析仪为美国BIO-RAD公司产品; Gene Genius Bio Imaging System紫外凝胶分析系统为SynGene公司产品; HLC-723G7糖化血红蛋白定量分析仪为日本希森美康公司产品; 日立7600-020全自动生化分析仪为日本日立HITACH株式会社生产。主要试剂:DNA Extraction Kit、PCR反应引物、DNA Fragment Purification Kit 为日本TaKaRa 公司产品; 糖化血红蛋白试剂为希森美康公司配套产品; 生化试剂由德赛诊断系统(上海)有限公司提供。

二、方法

1.引物

引物参照剑桥序列(Revised Cambridge Reference Sequence)合成。上游为5'-TACTTCACAAAGCGCCTTCC-3', 下游为5'-ATGA-AGAATAGGGCGAAGGG-3'。

2.反应体系

2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μ L, 10× Ex Taq Buffer 2.0 μ L, 25 mmol/L MgCl₂ 1.5 μ L, 10 μ mol/L引物各0.2 μ L, 5 U/μ L Ex Taq酶0.1 μ L, 加无菌双蒸馏水至25 μ L。

3.循环参数

94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min, 60 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 72 ℃延伸5 min。

4. DNA测序

将PCR纯化产物送至大连宝生物公司测序, 测序结果用DNA STAR软件包中的Seqman进行分析, 用其中的MegAlign进行与标准序列的比对分析, 查找变异位点。

三、统计学方法

用SPSS11.0统计软件分析。计量资料各参数以 ± s表示, 采用t检验。计数资料采用χ ²检验及Fisher精确概率法, P< 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、线粒体T3394C基因突变

在225例糖尿病研究组中检出8例有T3394C点突变(3.56%); 对照组有1例T3394C点突变(0.53%), T3394C点突变在糖尿病组发病率显著高于对照组(P< 0.05)。

二、有T3394C点突变患者年龄分布

8例有T3394C点突变T2DM患者年龄均大于45岁, 见表1。

表1 T3394C突变年龄分段情况表

三、有或无T3394C基因突变患者临床资料比较

根据测序结果, 将糖尿病组分为有T3394C点突变组和无T3394C点突变组, 2组间的临床资料比较, 见表2。其中突变组HbA1C、FBG显著高于无突变组, 2组间差异有统计学意义(P< 0.05), 而其他临床资料在2组间差异无统计学意义(P> 0.05)。

表2 有T3394C突变与无T3394C突变T2DM患者临床资料比较

四 DNA测序结果分析

将全部测试样本PCR产物纯化后直接测序, 对有T3394C突变的样本进行反向测序。测序结果, 见图1。

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	图1 测序结果注:(a)为野生型, (b)为突变型

讨论

线粒体是真核细胞内重要的细胞器, 是细胞内能量转换、贮存和供给的场所。人的线粒体基因(mtDNA)编码2种RNA(16s和12s), 22种tRNA及13种与细胞氧化磷酸化有关的酶蛋白亚单位, 这13种亚单位与核DNA编码的其他酶蛋白亚单位一起共同组成呼吸链^[1]。线粒体基因突变引起的线粒体疾病可累及全身多个组织器官, 如心脏、骨骼肌、脑等, 同时与肿瘤、衰老、退行性疾病如糖尿病等密切相关^[25]。

糖尿病的病因复杂, 一般认为是遗传因素和环境因素相互作用的结果, 其中遗传因素较为突出。遗传因素中线粒体基因突变是较常见的一种, 线粒体糖尿病的一个显著特征就是基因型与临床表型的关系十分复杂, 所以难于对其全面深入的理解。本实验主要探讨线粒体DNA ND1 T3394C基因突变与T2DM的关系。

1996年, Hirai等^[6]发现日本糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突变, 其突变率为4.9%, 正常人群为1.3%。目前国内外报道的T3394C突变在T2DM人群中发生率为3.0%6.0%, 正常对照人群为02.06%^[7]。其发病机理为:T3394C点突变可使一个中性酪氨酸被亲水性组氨酸取代, 改变了ND1空间构型, 进而影响NADH脱氢酶活性, 导致ATP合成减少, 胰岛β 细胞能量供应不足, 影响胰岛素分泌, 从而参与T2DM的发生。

以往的研究表明^{[8, 9]}, 衰老过程中存在着mtDNA突变, 故有学者把衰老看成是一种“ 与年龄有关的线粒体疾病” , 并证实线粒体突变、缺失是随着增龄不断积聚。从本研究中也可看出, 随着年龄的增长, T3394C的突变率在上升, 45岁以下的T2DM患者T3394C突变率为0, 而45岁以上的突变率为5.59%, 经统计学分析, 45岁以上的突变率显著高于45岁以下患者(P< 0.05)。推测年龄因素对于突变发生率增加可能起一定作用, 但在正常对照组中不存在这种趋势, 说明年龄并不是产生这种现象的主要因素, 还与其他遗传因素、环境、核基因、其他突变基因等共同作用下, 导致线粒体DNA变异积累, 当其突变达到一定阈值时才导致糖尿病的发生。

对临床资料进行统计分析, 有T3394C突变组HbA1C、FBG显著高于无T3394C突变组, 2组间差异有统计学意义(P< 0.05); 而性别、年龄、发病年龄、病程、TG、TC、LDL-C、HDL-C、P2BG、BMI等指标在2组间差异无统计学意义(P> 0.05), 血糖的升高对突变的发生可能起了诱导作用。

总之, 糖尿病的发病机制复杂, 本研究发现线粒体DNA ND1基因T3394C可能参与了T2DM的发生, 需要增大样本量来进一步证实, 为T2DM患者提供临床风险预报, 早发现、早治疗、减少并发症的发生有极其重要的临床意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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Sequence and organization of the human mitochondrial genome

... 人的线粒体基因(mtDNA)编码2种RNA(16s和12s),22种tRNA及13种与细胞氧化磷酸化有关的酶蛋白亚单位,这13种亚单位与核DNA编码的其他酶蛋白亚单位一起共同组成呼吸链^[1] ...

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Study on the mitochondrial DNA mutations in familial diabetes mellitus in Chinese population

目的研究线粒体基因11个已知突变或变异在中国家族性糖尿病人群中的确切发生率及其与糖尿病的相关性.方法应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态结合直接测序方法对随机抽取的无亲缘关系的770个糖尿病家系的先证者及309名非糖尿病对照者进行线粒体基因tRNALeu(3243,3256),tRNASer(12258),tRNAGlu(14709),tRNALys(8296,8344.8363),NDI(3316,3394,3426),ND4(12026)区11个已知位点突变或变异的筛查.结果糖尿病先证者组中发现13例tRNALeu3243 A→G突变(1.69%),9例tRNAGlu14709 T→C变异(1.17%),17例ND1 3316 G→A变异(2.21%),18例ND13394 T→C变异(2.34%),28例ND412026 A→G变异(3.63%);在正常对照组中发现5例14709 T→C变异(1.62%),5例3316 G→A变异(1.62%)和6例3394 T→C变异(1.94%),9例12026 A→G变异(2.91%),未见到3243 A→G突变携带者.在两组中均未见到tRNALeu3256C→T,tRNALys 8296A→G,tRNALys8344A→G,tRNALys 8363G→A,tRNASer 12258C→A和ND1 3426 A→G突变.分别比较14709,3316,3394,12026位点变异在糖尿病先证者组和对照组的发生率以及临床资料,差异无统计学意义.在糖尿病先证者组中尚见到同时伴有两个位点改变的情况,其中3243 A→G突变和3394 T→C变异者2例,3243 A→G突变和12026 A→G变异2例.结论线粒体基因tRNALeu(UUR) 3243 A→G突变是中国人线粒体糖尿病的主要致病基因,14709,3316,3394,12026位点变异可能是中国人线粒体基因多态,中国人群中未见到tRNALeu 3256C→T,tRNALys 8296A→G,tRNALys 8344A→G,tRNALys 8363G→A,tRNASer 12258C→A和ND1 3426 A→G突变,它们可能不是中国人线粒体糖尿病的致病基因. Abstract： Objective To assess the prevalence of mutations or variants of the mitochondrial DNA (mtDNA)in familial diabetes mellitus in Chinese population,and to explore the relationship between mtDNA mutations or variants and diabetes.MethodsSeven hundred and seventy randomly selected,unrelated probands of diabetes pedigrees and 309 controls over 60 years of age with normal glucose tolerance were recruited.PCR-RFLP and PCR-direct sequencing were applied to the screening of mtDNA mutationsor variants.including the mutations at nucleotides 3243,3256 in tRNALeu region,12258 in tRNASer region,14709 in tRNAGlu region,8296,8344,8363 in tRNALys region,3316.3394,3426 in ND1 region and 12026 in ND4 region.Results In the diabetic group,13(1.69%)had mt3243 A→G mutation,9(1.17%)had tRNAGlu 14709 T→C variant,17(2.21%)carried rot3316 G→A variant,18(2.34%)had mt3394 T→C variant,and 28(3.63%)harbored the 12026 A→G variant.In the control group,the 14709,3316,3394,12026 variants were detected in 5(1.62%).5(11.62%),6(1.94%),and 9(2.91%)subjeets respectively.The 3256.8296,8344,8363,3426 and 12258 point mutations were not detected both in the diabetic patients and the controls.In the diabetic group,we found two double mutations,one was A3243G and T3394C.the other was A3243G and A12026G.Except that the A3243G mutation was only observed in the diabetic grouP,the frequencies of the other variants mentioned above were not statistically different between the diabetic and control groups.Moreover,clinical characteristics such as age of onset,BMI.and insulin resistance index were not different between diabetic patients with and without the variants.Conclusion The tRNALeu(UUR)3243 A→G mutation may be the major cause of diabetes,representing 1.69%of the familial diabetes mellitus in Chinese.The other variants may be polymorphisms in this population,and the mutations not detected in our studied population may not be common contributors to diabetes mellitus in Chinese.

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. 1996, 219(3):null-null

Mitochondrial DNA 3394 mutation in the NADH dehydrogenase subunit 1 associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus

... 1996年,Hirai等^[6]发现日本糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突变,其突变率为4 ...

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... 以往的研究表明^[8,9],衰老过程中存在着mtDNA突变,故有学者把衰老看成是一种#cod#x0201c ...

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... 以往的研究表明^[8,9],衰老过程中存在着mtDNA突变,故有学者把衰老看成是一种#cod#x0201c ...