引用本文
王志林, 曹祥山, 邹昭玲, 钱新瑜, 谢晓宝. 核形正常的慢性淋巴细胞白血病13q14缺失的研究. 2011, 26(2): 114-117
WANG Zhilin, CAO Xiangshan, ZOU Zhaoling, QIAN Xinyu, XIE Xiaobao. Research of 13q14 deletion of chronic lymphocytic leukemia with normal karyotype. Labratory Medicine, 2011, 26(2): 114-117  
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核形正常的慢性淋巴细胞白血病13q14缺失的研究
王志林, 曹祥山, 邹昭玲, 钱新瑜, 谢晓宝
常州市第一人民医院血液实验室,江苏 常州 213003

作者简介:王志林,男,1972年生,副主任技师,主要从事白血病的遗传学研究。

基金:卫生部基金资助项目(WKJ2007-3-001)
摘要
目的

研究核形正常的慢性淋巴细胞白血病(CLL)13q14缺失的情况。

方法

运用位于13q14的序列特异性DNA探针RB1、D13S319、D13S25和间期荧光原位杂交(I-FISH)技术对26例初发的CLL患者进行染色体13q14的检测。

结果

26例B-CLL中12例(46.1%)有13q14缺失,阳性细胞率为25.0%90.0%,其中RB1单独缺失0例,D13S319单独缺失3例(11.5%),D13S25单独缺失3例(11.5%);RB1、D13S319、D13S25同时缺失1例(3.9%),D13S319、D13S25同时缺失有5例(19.2% )。

结论

CLL患者13q14缺失区域是不恒定的,而I-FISH是研究13q14缺失准确而快速的方法。

关键词: 荧光原位杂交; 慢性淋巴细胞白血病; 13q14缺失
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)02-0114-04
Research of 13q14 deletion of chronic lymphocytic leukemia with normal karyotype
WANG Zhilin, CAO Xiangshan, ZOU Zhaoling, QIAN Xinyu, XIE Xiaobao
Department of Hematology, the First People's Hospital of Changzhou, Jiangsu Changzhou 213003,China
Abstract
Objective

To investigate the incidence of 13q14 deletion in chronic lymphocytic leukemia (CLL) with normal karyotype.

Methods

Sequence-specific DNA probes RB1, D13S319 and D13S25 for 13q14 and interphase fluorescence in situ hybridization(I-FISH) were applied to detect 13q14 deletion in 26 patients with incipient CLL.

Results

12 (46.1%) out of 26 patients had 13q14 deletion,and the positive cell rate was 25.0%-90.0%. Among the patients, no one had 13q14 deletion with RB1,3 patients (11.5%) had 13q14 deletion with D13S319, 3 patients (11.5%) had 13q14 deletion with D13S25,1 patients (3.9%) had 13q14 deletion with RB1,D13S319 and D13S25,and 5 patients (19.2%) had 13q14 deletion with D13S319 and D13S25.

Conclusions

The region of deletion at 13q14 is variable, and the I-FISH is a rapid and accurate method for the analysis of 13q14 deletion in CLL.

Keyword: Interphase fluorescence in situ hybridization; Chronic lymphocytic leukemia; 13q14 deletion
引言

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种低度恶性的淋巴增殖性疾病, 多见于老年人, 形态学表现为成熟的小淋巴细胞, 在外周血、骨髓、淋巴结、脾中克隆性增殖, 主要为B细胞性, T细胞性仅占5%。染色体的异常是影响CLL预后和进展的重要因素。13q14缺失是B细胞CLL最常见的染色体异常, 单纯del(13q14)预后较好[1]。由于大多CLL细胞处于G0期, 有丝分裂活性较低, 故CLL的染色体研究进展缓慢, 间期荧光原位杂交(I-FISH)技术的应用由于不受细胞分裂的影响, 大大促进了CLL遗传学的研究[7, 8]。我们运用I-FISH技术, 采用位于13q14的序列特异性DNA探针GLP RB1、GLP D13S319、GLP D13S25, 回顾性地检测了26例核正常的CLL del(13q14)的发生情况。

材料和方法
一、研究对象

26例来自常州市第一人民医院2004年1月至2008年1月的CLL的初诊患者的骨髓染色体标本, 这26例标本免疫分型均为B-CLL。所有病例诊断均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[2]。I-FISH对照组选用同期8例非血液系统恶性疾病标本, 这8例对照都是门诊怀疑智力有问题而核形正常的儿童染色体标本。

二、常规染色体分析

取肝素抗凝的骨髓标本, 经有核细胞计数之后以(13)× 106的细胞密度接种到2个培养基中作短期培养法, 不加有丝分裂原刺激剂, 培养24 h, 于中止培养前3 h加入秋水仙素, 终浓度为0.2 μ g/mL, 经低渗、固定处理后收获细胞, 采用R显带法姬姆萨(Giemsa)染色体, 每个标本分析20个中期分裂相, 核形描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2005)》。

三、I-FISH

试剂为北京金菩嘉医疗科技有限公司, 探针采用针对13q14的SpectrumOrange标记的序列特异性DNA探针D13S319和D13S25, 以及SpectrumGreen标记的序列特异性DNA探针RB1(GLP RB1)。探针D13S325远离着丝粒端, 而RB1探针在近着丝粒端, 探针D13S319位于RB1和D13S25位点之间。

取出于-20℃储存的核形正常的染色体标本, 换用新鲜的甲醇/冰醋酸(3∶ 1)固定液, 气干法滴片, 每份标本滴3张玻片, 隔夜老化, 置于常温2× 氯化钠柠檬酸钠溶液(SSC)中脱水5 min, 在70%、85%、100%室温乙醇中梯度脱水各2 min, 晾干。

探针处理:每份标本取探针1 μ L, 加杂交稀释液4 μ L混匀, 将探针混合液5 μ L加于玻片的待杂交区, 盖上盖玻片。用Rubber Cement封片后, 放于ThermoBrite自动原位杂交仪中, 程序设定78 ℃变性5 min, 42 ℃杂交20 h。杂交结束后, 洗片, 去除盖玻片, 将玻片置于46 ℃的0.3%NP-40/0.4× SSC中洗涤2 min, 再置于室温0.1NP-40/2× SSC 中洗涤45 s, 置于2× SSC中脱水4 min, 再置于70%的酒精中脱水4 min, 取出玻片, 晾干, 复染, 吸取10 μ L的DAPI于杂交区, 置于4 ℃冰箱, 待30 min后观察结果。

检测:用OLYMPUS BX51正置荧光显微镜在4, 6-二联脒-2-苯基吲哚/异硫氰酸荧光素/罗丹明(DAPI/FITC/RHOD)滤光片的激发下, 观察间期细胞的桔红色和绿色荧光杂交信号, 每例至少分析200个细胞, 计数边界清楚, 无重叠, 结构完整的细胞核, 用德国耶拿CCD摄像头进行图像采集, 使用IMSTAR软件进行图像分析。

四、统计学方法

使用SPSS13.0统计学软件, 计数资料采用χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
一、正常对照组

正常间期细胞用视网膜母细胞瘤基因(RB1)探针杂交, 可见到2个绿色杂交信号, 见图1。用D13S25和D13S319探针杂交, 分别可见2个桔红色杂交信号, 见图2。分析8例非血液系统恶性疾病核型正常患者, 每个标本分析300个间期细胞, 两个信号点之间的距离必须超过1个信号点的长度才能计算为两个信号点, 出现1个信号点的细胞为探针位点缺失, 无信号则为纯合性缺失。根据正常对照组 ± 3s以确定RB1、D13S319、D13S25位点的阈值, 阈值分别为7.1%、5.2%、8.4%。

图1 正常的RB1杂交信号

图2 正常的D13S319、D13S25信号

二、病例组

26例B-CLL中12例(46.1%)有13q14缺失, 阳性细胞率为25.0%90.0%, 其中RB1缺失1例(3.9%), 见图3。D13S319缺失9例(34.2%), D13S25缺失9例(34.2%), 见图4。RB1、D13S319、D13S25同时缺失1例, D13S319、D13S25同时缺失有5例(19.2% )。缺失都为杂合子, 未见有纯合子缺失。

图3 RB1缺失信号

图4 D13S319、D13S25信号缺失

三、3组探针之间的差异性比较

RB1缺失与D13S319、D13S25缺失相比, 差异有统计学意义(P< 0.05), 见表1。

表1 B-CLL的13q14缺失
讨论

CLL细胞有丝分裂低下, 常规染色体显带技术仅20%的患者可检测到克隆性染色体异常, 加用有丝分裂原刺激剂后近50%的CLL可检测到异常, 常见的异常是12三体, 其次为13号和14号染色体长臂的结构异常。FISH是一种利用非放射性物质标记核酸探针结合荧光素在间期核和中期相上检测特定DNA序列的新技术, 既可检测分裂相, 也可检测间期细胞, 具有快速、准确、敏感等优点。应用FISH, 约70%CLL患者可检测到染色体异常, 其中del(13q14)最常见, 其次为del(11q22-q23)、+12、del(17p13)和del(6q21)[3, 6]。

CLL的13号染色体长臂是目前研究最多的染色体结构异常, 由于慢性淋巴细胞有丝分裂低下, 所以常规染色体往往不能检测到染色体异常, 镜下看到的染色体往往是正常细胞的分裂相。运用荧光原位杂交技术, 我们发现大约46.2%核形正常的CLL患者检测到13q缺失, 该技术能对非分裂细胞进行分析, 弥补了常规染色体显带技术的不足。

13q缺失通常涉及长臂的1区4带, 但是缺失长度仍未被确切定义。一些研究表明[5, 8], 缺失区域可能只为13q14, 也可能伴有更大片段的缺失, 早期研究发现, 肿瘤抑制基因-成视网膜母细胞瘤基因(RB1)位于13q14区, del(13q14)可造成该基因的缺失, 认为RB1是CLL的候选抑癌基因, 以后研究发现, RB1的缺失很少见, 我们的研究也证实了这一观点, 只有1例患者有RB1的缺失, 而且是和D13S319、D13S25同时缺失。我们推测RB1缺失只是疾病进展过程中出现的, 先有D13S319、D13S25缺失, 随着病情的加重, 13q14缺失区域的扩大, 累积到了RB1基因, 造成了RB1的缺失。

我们的研究证实13q14缺失大多集中在D13S25和D13S319之间, 推测del(13q14)的关键基因可能位于RB1基因远端的2个标志D13S25和D13S319之间, 约为300bp的区域内, 其突变或缺失, 可导致细胞增殖、失去负调控而致肿瘤发生。

Dohner等[4]研究结果显示, 伴del(13q)异常的CLL患者, 中位生存期(MS)133个月。Mayr等[5]应用一系列探针对93例CLL患者进行检测, 发现伴有其他易位的13q患者中位生存期明显短于单纯del(13q)患者。实验结果显示, 1例RB1、D13S319、D13S25同时缺失的患者, 生存期只有18个月, 推测患者的白血病细胞有染色体复杂核形, 只是我们没有发现白血病细胞的分裂相。

我们的实验中运用ThermoBrite自动原位杂交仪, 减少FISH流程中手工操作步骤及手工操作时间, 确保所有处理标本的一致性和精确性, 节省时间, 而且杂交信号的质量都比较高。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[8] Glassman AB, Hayes KJ. The value of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2005, 158(1): 88-91. [本文引用:2] [JCR: 1.929]