引用本文
金中淦, 胡香南, 葛平, 徐蓉, 陈蓉, 刘学杰, 吴文娟, 王庆忠. 检测结核分枝杆菌的BSL-2实验室污染状况的实验评价. 26(12): 869-873
JIN Zhonggan, HU Xiangnan, GE Ping, XU Rong, CHEN Rong, LIU Xuejie, WU Wenjuan, WANG Qingzhong. The biosafety evaluation of BSL-2 laboratory during testingMycobacterium tuberculosis . Labratory Medicine, 26(12): 869-873  
Permissions
Copyright©2011, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
检测结核分枝杆菌的BSL-2实验室污染状况的实验评价
金中淦1, 胡香南2, 葛平1, 徐蓉1, 陈蓉1, 刘学杰1, 吴文娟2, 王庆忠1
1. 上海市临床检验中心,上海 200126
2. 上海市公共卫生临床中心,上海 201508

通讯作者:王庆忠,联系电话:021-68316300-1203。

作者简介:金中淦,女,1982年生,硕士,技师,主要从事临床检验工作。

基金:国家十一五＂艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治＂重大专项(2009ZX10004-505);
摘要
目的

通过检测生物安全二级(BSL-2)实验室结核分枝杆菌(MTB)的污染情况,对BSL-2实验室安全性进行评估。

方法

用FA-2型撞击式空气微生物采样器采集MTB检验前、中、后的空气样本收集于血平板和生理盐水采样介质;用物表采样规格板和棉拭子采集物体表面样本。血平板采集的空气样本孵育后,挑取菌落行革兰染色镜检和16S rRNA菌种鉴定。物表样本和以生理盐水为介质的空气样本经N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)/NaOH前处理,采用MTB特异性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MTB;同时接种改良罗氏中性培养基和MTB液体培养基培养MTB。

结果

改良罗氏中性培养基未见分枝杆菌生长,液体培养基检出的2例分枝杆菌经测序证实分别属于MTB复合群和脓肿分枝杆菌;有2%(15/779)的样本MTB核酸阳性,且均来自进行药敏试验的2个BSL-2实验室;有26.7%(8/30)的来自生物安全柜的血平板采样的样本平皿菌落量达2+或以上,测序分析显示主要为葡萄球菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属。

结论

受检医院BSL-2实验室MTB污染状况总体可控,但进行MTB药敏试验的实验室应重点加强生物安全防护。

关键词: 结核分枝杆菌; 生物安全二级实验室; 生物安全
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0869-05
The biosafety evaluation of BSL-2 laboratory during testingMycobacterium tuberculosis
JIN Zhonggan1, HU Xiangnan2, GE Ping1, XU Rong1, CHEN Rong1, LIU Xuejie1, WU Wenjuan2, WANG Qingzhong1
1.Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
2.Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China
Abstract
Objective

To evaluate the safety of biosafety level Ⅱ (BSL-2) laboratory by detecting the contamination ofMycobacterium tuberculosis(MTB).

Methods

The air samples were collected before, during and after the detecting of MTB using the FA-2-type air sampler. The facility surface samples were obtained by physical specification table plate and swab. The colonies on blood agar after incubation were picked out for Gram staining and 16S rRNA strain identification. The air samples in normal saline were decontaminated by N-acetylcysteine sodium hydroxide (NALC/NaOH) methods. The decontaminated samples were detected by MTB-specific fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) and inoculated onto Lowenstein Jensen media and BACTEC MGIT 960 liquid medium tubes.

Results

Two cases of mycobacteria were detected on liquid medium, but there was none on Lowenstein Jensen media. Confirmed by sequencing, one mycobacterium belonged to MTB complex species, and the other one wasMycobacterium abscessus. Out of 779 samples processed, 2% (15/779) samples were positive by MTB-specific fluorescence quantitative PCR. All positive samples were from 2 BSL-2 laboratories which carried out MTB drug susceptibility test. The colonies on 8 blood agar out of 30 specimens collected from biological safety cabinets amounted to 2+ or more, and further confirmed asStaphylococcus,Bacillus andAcinetobacter predominantly by sequencing.

Conclusions

The MTB contamination in the BSL-2 laboratories accepting inspection are controlled generally. However, the laboratories carrying out drug susceptibility testing of MTB need to strengthen biological safety protection.

Keyword: Mycobacterium tuberculosis; Biosafety level Ⅱ laboratory; Biosafety

结核病是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的传染性疾病,是当今全球范围对人类最具有威胁性的疾病之一。据世界卫生组织报道,2009年全球新发结核患者约900万,约有170万人死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一[ 1]。我国活动性肺结核患者数居世界第2位,全国约5.5亿人受到了MTB感染[ 2]。有研究报道传染病除了通过生活接触、空气、水源等途径传播以外,实验室已成为重要的传播途径。实验室生物安全问题已越来越受关注,忽视生物安全可导致病原体感染实验室工作人员或泄露到周围环境中造成严重后果,生物安全成为全世界生物医学实验室共同关注的问题[ 3]。1979至1999年间,世界各地报道的实验室感染个案中,结核有223例,感染率居首位[ 4]。因此,检测和监测MTB实验活动中实验室环境的污染,评价发生实验室污染的关键环节,对实验室生物安全工作具有借鉴意义。

我们采用快速分子诊断和常规病原学方法对采集的样本进行特异性检测分析,评估上海市具有代表性的,具备进行结核病筛查、病原菌培养及治疗资质医院的生物安全二级(BSL-2)实验室的MTB污染情况,以规范实验室的日常操作。

材料和方法
一、研究对象

选择上海市具有代表性的,具备进行结核病筛查、病原菌培养及治疗资质的15家医院的BSL-2实验室。实验室相关MTB操作按照标准化操作程序进行。

二、试剂和仪器

1.主要试剂和耗材 血平板(上海科玛嘉生物技术有限公司)、无菌空平皿(浙江拱东医疗科技有限公司)、结核液体培养基(BD公司)、改良罗氏培养基(上海肺科医院)、MTB核酸检测试剂盒[聚合聚链反应(PCR)-荧光探针法,凯杰生物]、16S rRNA鉴定PCR试剂(上海生工)、50 mL离心管、灭菌棉签、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS,pH值6.8)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)/NaOH消化液、采样规格板(5 cm×5 cm)。

2.主要仪器 BACTEC MGIT- 960 全自动分枝杆菌快速培养仪(简称MGIT-960,BD公司)、NUAIR 2B Ⅱ级生物安全柜、ABI7500实时荧光定量PCR检测仪、二氧化碳恒温培养箱(Heraeus)、ABI9700普通PCR仪、FA-2型撞击式空气微生物采样器。

三、方法

1.采样 (1)物体表面采样方法:用生理盐水湿润棉签,使用采样规格板采样,将采样棉签放入50 mL离心管中密闭;每采样一次,用75%的酒精擦拭规格板;不能用采样规格板采样的点,记录采样面积;(2)空气采样:用FA-2型撞击式空气微生物采样器,采用惯性撞击原理,将悬浮在空气中的微生物粒子收集在采样介质表面上;实验前每个采样点用含5 mL生理盐水的平皿和血平板各采2个样,实验中、后每个采样点用含5 mL生理盐水的平皿采2个样,采样流量为28.3 L/min,采样时间约为20 min;(3)采样点的选择:选择采集实验前后实验准备间、实验区、生物安全柜的空气样本,在实验人员进行涂片、离心、接种操作过程中进行空气采样,多数实验室未分出独立的实验准备间。物表采样点主要是在实验前选择显微镜载物台,镜头旋钮,污物桶盖,冰箱门把手,培养箱上、中、下层以及门把手,生物安全柜操作台面左前、左后、右前、右后、中间以及左风口、右风口、生物安全柜按钮,实验后选择生物安全柜操作台面左前、左后、右前、右后、中间以及左风口、右风口,实验人员手套及实验中所使用过相关器材如培养基盒、生物安全柜内电热板等的物体表面。

2.样本处理 分别用高压灭菌后的镊子小心将采样棉签上的液体挤出,棉签丢弃;轻轻摇晃使生理盐水接触整个平皿底部,将平皿中的生理盐水收集到无菌50 mL离心管中。用NALC/NaOH处理后进行MTB培养和核酸检测。

3.核酸定量检测 采用MTB特异性荧光定量PCR-Taqman法,操作方法参照说明书。

4.血平板培养结果的判定 孵育48 h后观察血平板,记录菌落生长情况并挑取菌落行革兰染色,观察染色结果。

5.16S rRNA鉴定 挑选所需鉴定的菌种,血平板划线纯化菌落,2 d后观察菌落生长情况。在1.5 mL EP管中添加500 μL的生理盐水,挑取单个纯化的菌落至EP管中,震荡混匀。将EP管放置到95 ℃金属浴中20 min,13 000 r/min(离心半径7.5 cm)离心10 min。取上清作为核酸模板。PCR扩增引物序列:F 5'-AGTTTGATCCT GGCTCAG-3'和R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR产物由上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序,再与 GenBank 序列比对分析鉴定菌种。

6.中性改良罗氏培养基和结核液体培养基结果的判定 每3天观察1次中性罗氏培养基,若有疑似污染,涂片后进行抗酸染色及革兰染色,并镜检;若有疑似MTB菌落生长形成,则涂片后做抗酸染色,镜检判断是否为抗酸杆菌。8周后若仍未见有分枝杆菌生长,则判定为阴性。每日观察MGIT-960,出现阳性样本,仪器红色指示灯立即闪亮,阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色,确定是否为分枝杆菌;仪器绿色指示灯闪亮即为阴性。

结果
一、样本检测的总体情况

15家医院共采集样本843份,采样情况见 表1。

表1 采样类型总体情况
二、BSL-2实验室分枝杆菌污染情况

1.分枝杆菌培养结果 除血平板外的779份样本经MGIT-960培养出分枝杆菌2例,测序证实1例属于MTB复合群,另1例为脓肿分枝杆菌( Mycobacterium abscessus)。改良罗氏中性培养基未培养出分枝杆菌。2例分枝杆菌的实验室位置分布和采样阶段见 表2。

表2 分枝杆菌的实验室位置分布和采样阶段

2.MTB核酸检测结果 对779份样本进行了MTB荧光定量PCR检测,其中有15份(2%)样本MTB核酸阳性,且均来自进行药敏试验的2个BSL-2实验室,15份核酸阳性样本中有1例培养为阳性。其他13家实验室在实验前、中、后均未检测到MTB核酸。15份核酸阳性样本的实验室位置分布和采样阶段见 表3。

表3 15例MTB核酸阳性样本的实验室位置分布和采样阶段
三、BSL-2实验室普通微生物污染情况

64份血平板培养生长细菌共108株,经革兰染色镜检后具体分类见 表4。16S rRNA菌种鉴定成功,其中52株分别属于16种菌属,主要菌种分布见 表5。 64份血平板中采集生物安全柜中空气的血平板有30份,其中8份血平板上菌落量达2+或以上,经测序分析证实主要为葡萄球菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属。

表4 血平板培养生长细菌革兰染色鉴定结果[例(%)]
表5 实验室普通微生物菌种分布
讨论

近年来有关实验室生物安全问题越来越引起人们的重视,国内有不少有关生物安全防护[ 5]、生物安全管理[ 3]、防护设备调查[ 6]等报道。而涉及MTB生物安全的文献较少[ 7],主要为说明操作规范的标准操作程序(SOP),缺乏相应的实验数据支持。国外文献有针对MTB不同实验方案的生物安全评估[ 8, 9],未见针对检测MTB的整个实验过程BSL-2实验室污染状况的报道。

2010年,上海市有报道的涂片总量为61 233张,阳性检出数为7 269张,检出率为11.87%,痰培养量为21 831例,培养阳性检出数为2 500株,阳性检出率为11.34%。选择的15家医院MTB检测工作量占上海市的三分之二以上。在日常检测MTB的实验活动中难以避免产生气溶胶,如痰样本混匀、样本涂片、培养液的倾倒和转移、离心、开启培养皿和安瓿,意外事件如培养物的溅出、泼洒和离心管破碎等都可造成严重污染。大部分实验室感染人员主要是因为吸入在处理临床样本和培养物过程中产生的含病原体的气溶胶所致。在结核病患者活动较多的医疗卫生单位,医务人员存在较高的感染风险。结核防治工作人员结核病发病水平显著高于一般人群,其中医务人员显著高于非医务人员[ 10]。因此,检测和监测MTB实验活动中实验室环境的污染,评价发生实验室感染的关键环节,对于预防实验室感染具有重要意义。

本研究中LJ固体培养基未培养出分枝杆菌,可能所采样本中菌量太少,LJ固体培养基敏感性低。荧光定量PCR检测具有敏感性高、诊断速度较快等优点,但仍不可避免出现假阳性反应。本研究15份PCR阳性样本仅1例培养为阳性,另外对非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacterial,NTM)的检测仍存在缺憾。MGIT-960作为一种标准化的培养系统,能促进分枝杆菌生长,具有速度快、敏感性高等优点,但也不能完全取代传统培养方法,样本在首次分离中建议与传统培养法联合使用,以提高检出率[ 1113]。本研究采用三者相结合的方法保证了分枝杆菌的检出效果。

本研究采用MTB荧光探针检测法在采集的空气中未检测到MTB核酸,也未培养出病原菌,但在传递窗里侧下表面、实验员手掌、保种管、温箱、生物安全柜按钮、实验室内门把手、离心机筒、离心机筒按钮上均检测到致病菌核酸,虽然大部分是灭活的病原体残留,但仍不能排除是活的致病性病原体污染。本研究检测到的15份阳性样本有1例培养为阳性。因此,在BSL-2实验室每次MTB检测后应注意实验区域的清洁和消毒灭菌工作,尤其要加强以上核酸检测阳性区域的灭菌工作。另外建议实验人员应尽量减少实验物品进出安全柜的次数,减少对安全柜外仪器的污染。及时更换手套也是可行的方法。本研究在临床实验室采样中发现部分实验人员的生物安全意识不强。在实验操作中,遇到厂家送检测试剂,直接中断操作,带着操作手套在送货单上签字。这些签字单将成为实验室污染的传播源。

本研究只在进行药物敏感性试验的工作人员手套上分离到1株属于MTB复合群的分枝杆菌,在其他所采集的空气样本和物表样本都未检测到MTB。提示在药敏操作中尤其要提高警惕,做好生物安全防护工作。庆幸的是,阳性MTB分离株所在的BSL-2实验室人员的安全防护工作做得很到位,所有废弃物都在离开实验室前进行了高压灭菌,而且实验室的设计符合要求,准备间、缓冲间、实验间分明,而其他大部分实验室缺乏合适的布局。

值得注意的是,本研究在BSL-2实验室中检测到1例脓肿分枝杆菌。脓肿分枝杆菌属于快速生长分枝杆菌Ⅳ群龟分枝杆菌的1个亚种,可引起脓肿、肺部和伤口感染,主要通过污染的水或手术器械传播,具有潜伏期长、治疗时间长等特点,发病对象不受年龄限制,但免疫功能低下的人。其感染的概率较大,主要表现为术后感染如器官移植术后感染[ 14]、肌肉注射后感染[ 15]及脓肿分枝杆菌肺病[ 16]。据我国2000年第4次全国结核病调查报道,分离的分枝杆菌中NTM病为11.1%,较1990年的4.9%明显增加[ 2]。上海市NTM感染呈逐年上升趋势,感染菌种的分布以Ⅳ群快速生长的NTM为主,且NTM对常用的抗结核药物呈高度耐药[ 17]。2010年卫生部办公厅发布了关于加强NTM医院感染预防与控制工作的通知[ 18],这些都应引起实验工作者的高度重视,应按照相关要求配制浓度合格的消毒液,并及时更换,确保消毒工作质量,严防实验室污染的发生。

同时,在BSL-2实验室空气中采集到相当量的微生物,特别是大部分实验室的生物安全柜中存在普通环境微生物,主要为葡萄球菌属、芽孢杆菌属,这可能会给日常样本带来污染,造成检测结果的不准确,应加强消毒措施。

另外,本研究采用的实验技术存在不足,利用空气采样仪物理撞击原理采集空气中的分枝杆菌,由于直接采用生理盐水作俘获液体,易造成在采样器内形成气溶胶污染,同时最后收集的采样液体也存在一定的损耗;采样时间受到了实验室工作人员操作时间的限制,因而采集效果不甚理想,有待进一步完善采样器材和改进试验方法。另外实验操作人员的培训等情况存在差异较大,可能会影响实验结果。

总之,上海市BSL-2实验室MTB的污染状况总体可控,对实验室和环境不会造成污染。但应加强日常消毒灭菌工作,尤其是进行MTB药物敏感性试验的实验室应重点加强生物安全防护工作。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] World Health Organization. WHO report 2010 global TB control[EB/OL]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/2010/en/index.html, 2010-10-15/2011-03-15. [本文引用:1]
[2] 全国结核病流行学抽样调查技术指导组(全国结核病流行病学抽样调查办公室). 2000 年全国结核流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志, 2002, 24(2): 65-66. [本文引用:2]
[3] 袁介秋. 实验室生物安全与管理[J]. 职业卫生与病伤, 2006, 21(1): 38-39. [本文引用:2]
[4] 周乙华, 庄辉. 实验室感染与生物安全[J]. 中华预防医学杂志, 2005, 39(3): 215-217. [本文引用:1]
[5] 吴朝阳, 谭穗茹, 吴琼谊. 医院检验科感染性气溶胶的产生及生物安全防护[J]. 职业与健康, 2008, 24(3): 217. [本文引用:1]
[6] 陆龙喜, 林军明, 顾华. 生物安全实验室中生物安全柜使用现状调查[J]. 中国消毒学杂志, 2010, 27(4): 376-378. [本文引用:1]
[7] 王丽. 结核实验室的安全防护[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2002, 25(3): 189-190. [本文引用:1]
[8] Blackwood KS, Burdz TV, Turenne CY, et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a containment level-Ⅲ laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program[J]. BMC Infect Dis, 2005, 5: 4. [本文引用:1] [JCR: 3.025]
[9] Castro C, González L, Rozo JC, et al. Biosafety evaluation of the DNA extraction protocol for Mycobacterium tuberculosis complex species, as implemented at the Instituto Nacional de Salud, Colombia[J]. Biomedica, 2009, 29(4): 561-566. [本文引用:1] [JCR: 0.315]
[10] 王国杰, 马士文, 孟澜涛, 等. 河南省结核病防治人员结核病发病队列研究[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(10): 1206-1207. [本文引用:1]
[11] Chang HE, Heo SR, Yoo KC, et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis complex using real-time polymerase chain reaction[J]. Korean J Lab Med, 2008, 28(2): 103-108. [本文引用:1] [JCR: 0.723]
[12] Rishi S, Sinha P, Malhotra B, et al. A comparative study for the detection of Mycobacteria by BACTEC MGIT 960, Lowenstein Jensen media and direct AFB smear examination[J]. Indian J Med Microbiol, 2007, 25(4): 383-386. [本文引用:1]
[13] Sorlozano A, Soria I, Roman J, et al. Comparative evaluation of three culture methods for the isolation of Mycobacteria from clinical samples[J]. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(10): 1259-1264. [本文引用:1]
[14] Morales P, Gil A, Santos M. Mycobacterium abscessus infection in transplant recipients[J]. Transplant Proc, 2010, 42(8): 3058-3060. [本文引用:1]
[15] Bates TR, Keenher T, O'Reilly LC, et al. Extensive cutaneous Mycobacterium abscessus infection due to contaminated insulin delivery system[J]. QJM, 2009, 102(12): 881-884. [本文引用:1] [JCR: 2.361]
[16] Jar J, Levin A, Zhang L, et al. Clinical and microbiologic outcomes in patients receiving treatment for Mycobacterium abscessus pulmonary disease[J]. Clin Infect Dis, 2011 , 52(5): 565-571. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[17] Wang HX, Yue J, Han M, et al. Nontuberculous mycobacteria: susceptibility pattern and prevalence rate in Shanghai from 2005 to 2008[J]. Chin Med J (Engl), 2010, 123(2): 184-187. [本文引用:1]
[18] 卫生部办公厅发布关于加强非结核分枝杆菌医院感染预防与控制工作的通知[EB/OL]. http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohyzs/s3594/201006/47616.htm, 2010-06-03/2011-03-15. [本文引用:1]