引用本文
汪峰, 刘彩林, 廖亚龙, 汪月, 孙自镛. 应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液感染. 26(12): 865-868
WANG Feng, LIU Cailin, LIAO Yalong, WANG Yue, SUN Ziyong. Application of 16S rRNA broad range polymerase chain reaction for the rapid detection of bacterial infection in clinical body fluid. Labratory Medicine, 26(12): 865-868  
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应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液感染
汪峰, 刘彩林, 廖亚龙, 汪月, 孙自镛
华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,湖北 武汉 430030

通讯作者:孙自镛,联系电话:027-83663639。

作者简介:汪峰,男,1983年生,硕士,主要从事微生物感染方面的研究。

基金:国家科技重大专项＂十一五＂资助课题(2009ZX10004-107);
摘要
目的

应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应(PCR)快速检测临床无菌体液感染,并与传统培养方法进行比较分析。

方法

收集94份临床无菌体液(血液、脑脊液、胸腹水、关节液)标本,提取细菌基因组DNA,应用16S rRNA宽范围PCR扩增,并将PCR阳性产物测序,然后将测序结果在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行BLAST比对,从而确定菌种。同时,应用常规培养方法检测94份无菌体液标本,并对2种方法的结果进行比较。

结果

16S rRNA宽范围PCR敏感性高,最低扩增浓度为103 CFU/mL,且该技术特异性高,其阳性扩增产物经测序比对后结果和培养结果完全吻合。另外,94例临床标本中应用培养方法培养出阳性例数为9例,阳性率为9.6%,而应用宽范围PCR,除培养阳性的9例均为阳性外,另外扩增出6例阳性标本,阳性率为15.9%,而此6例经测序证实分别为4株铜绿假单胞菌、1株黏质沙雷菌、1株肺炎链球菌。

结论

16S rRNA宽范围PCR与培养技术比较起来,敏感性高,特异性强,有望成为临床无菌体液病原体感染快速筛查的方法。

关键词: 宽范围聚合酶链反应; 16S rRNA; 体液; 感染; 培养检测
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0865-04
Application of 16S rRNA broad range polymerase chain reaction for the rapid detection of bacterial infection in clinical body fluid
WANG Feng, LIU Cailin, LIAO Yalong, WANG Yue, SUN Ziyong
Department of Clinical Laboratory, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430030, China
Abstract
Objective

To investigate the application of 16S rRNA broad range polymerase chain reaction (PCR) to detect bacterial infection in clinical body fluid, and compare the results with traditional culture method.

Methods

94 samples of clinical body fluid (blood, cerebrospinal fluid, pleural and peritoneal fluid and synovial fluid) were collected. Bacterial genome DNA was extracted, and 16S rRNA broad PCR amplification was administrated. The positive products of PCR were sequenced to determine bacterial species, and the sequence results were compared by National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST. Meanwhile, 94 samples were also detected by culture assay, and the results were compared.

Results

16S rRNA broad range PCR was highly sensitive, and the lowest amplification concentration was 103 CFU/mL. The broad range PCR was also highly specific, and the coincidence rates between these 2 assays were 100%. In addition, 9 samples were positive by culture assay, and the positive rate was 9.6%. However, 15 samples were positive by broad range PCR assay, and the positive rate was 15.9%. Except 9 samples had the same results with culture assay, the other 6 samples were positive by broad range PCR, including 4 strains ofPseudomonas aeruginosa, 1 strain ofBacillus prodigiosus and 1 strain ofStreptococcus pneumoniae.

Conclusions

Compared with culture assay, 16S rRNA broad range PCR is highly sensitive and specific. It is hopeful to be a new method for the rapid screening of clinical body fluid infection.

Keyword: Broad range polymerase chain reaction; 16S rRNA; Body fluid; Infection; Culture assay

细菌感染至今仍是威胁人类健康的重大问题之一,而无菌体液如血液感染引起的后果更加严重,往往导致急危重症和多器官功能衰竭,病死率极高[ 1]。目前临床上多应用培养技术来诊断细菌感染,此方法虽然特异性高,但存在如下不足:(1)苛养菌或培养条件特别的细菌临床分离率低;(2)细胞内寄生的微生物或无法人工培养的微生物多培养阴性;(3)临床标本送检之前使用广谱抗菌药物也容易导致培养阴性;(4) 大部分细菌培养需要23 d才有结果,而一些类似真菌等缓慢生长的细菌则培养时间更长[ 2]。随着分子生物学技术的发展,应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增病原体核酸的方法已经越来越被人们所重视,该方法不仅结果准确可靠,且仅需数小时就可以发出报告,往往成为很多不易培养细菌鉴定的金标准[ 1, 2]。虽然PCR早已成为快速敏感的病原菌检测技术,但由于针对不同病原菌需要设计不同特异引物,从而限制了其临床实际应用。宽范围PCR是近几年迅速发展起来的一种分子生物学技术。该方法针对细菌体内保守的16S rRNA设计引物,通过使用1对引物,就可以扩增出大部分细菌病原体。然后通过将宽范围PCR产物测序,就可以直接得出细菌种属[ 3, 4]。我们对16S rRNA宽范围PCR体系进行摸索,并应用该技术检测临床标本,通过与经典的方法进行比较,从而对其敏感性、特异性及优势进行全面的探讨。

材料和方法
一、材料

1.标本来源 收集同济医院2010年2月至2010年5月住院患者无菌体液94例,其中血液10例、脑脊液42例、胸腹水30例及关节液12例。该94例标本均为临床高度怀疑有细菌感染,明确要求微生物室做细菌培养的标本。所有标本收到后,立即无菌分装成2份,一份用于普通培养,一份用于宽范围PCR扩增,且用于普通培养的标本接种完后均做涂片染色镜检。

2.标准菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 25922)、大肠埃希菌(ATCC 25923)共2株,购自卫生部临床检验中心。

二、方法

1. 常规细菌培养 临床标本收到后,分别接种于普通血平板、麦康凯平板和巧克力平板中,37 ℃孵育1824 h(巧克力平板放二氧化碳孵箱中)。未见菌落生长即为培养阴性;如有菌落生长,应用Vitek全自动细菌鉴定仪直接得出鉴定结果。

2. 细菌基因组DNA提取及16S rRNA宽范围PCR扩增 采用北京康为世纪生物科技有限公司细菌基因组提取试剂盒提取4种无菌体液基因组DNA,提取步骤按照试剂盒说明书进行。细菌总DNA提取完成后置-20 ℃保存。宽范围PCR上、下游引物P11和P13分别为5'-GAGGA AGGTGGGGATGACGT-3'和5'-AGGCCCGGGA ACGTATTCAC-3'。此引物可以扩增细菌16S rRNA的V7V8区[ 4]。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min,然后95 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;最后72 ℃延伸10 min。每次扩增临床标本时均包含阳性对照和阴性对照,阳性对照为金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌标准菌株,阴性对照为PCR体系中不加模板DNA。

3.基因测序和BLAST比对 所有阳性PCR产物均送至上海英俊生物技术有限公司测序。测序完成后,将序列输入GenBank中运用BLAST程序进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),从而确立菌名。在GenBank中比对结果同源性超过98%才能确立为同一种属。

结果
一、稳定的16S rRNA宽范围PCR体系的建立

经过反复摸索,稳定的宽范围PCR体系如下:总体积含25 μL,10×TagBuffer加入2.5 μL,4种10 mmol/L dNTP加入1.0 μL,100 pmol/L混合引物(P11、P13)加入2.0 μL, 模板DNA加入2.0 μL,TaqDNAase加入0.5 μL,25 mmol/L MgCl2加入1.0 μL,ddH2O加入16 μL。结果见 图1,16S rRNA宽范围PCR产物大小为200 bp左右。

图1 宽范围PCR体系的建立

二、16S rRNA宽范围PCR体系敏感性分析

将大肠埃希菌加入生理盐水中,调整浓度为107 CFU/mL,然后做倍比稀释,分别提取细菌基因组DNA,做16S rRNA宽范围PCR扩增,得出宽范围PCR的敏感性为103 CFU/mL,见 图2。且该方法重复性好,103 CFU/mL的大肠埃希菌经多次宽范围PCR扩增均为阳性。

图2 宽范围PCR敏感性分析

三、比较16S rRNA宽范围PCR和培养结果

94例临床无菌体液中,共有9例培养阳性,阳性率为9.6%。而利用宽范围PCR和测序显示,共有15例阳性结果,阳性率为15.9%。 培养阴性而宽范围PCR阳性的6例患者中,4株为血液中的铜绿假单胞菌,1株为胸腹水中的黏质沙雷菌,1株为肺炎链球菌,见 表1。 图3显示的是一例16S rRNA宽范围PCR阳性测序结果,将该序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行BLAST比对后发现,该序列为黏质沙雷菌的可能性为98%。以上结果显示16S rRNA宽范围PCR技术和普通培养技术比较起来,阳性率更高,且在诊断营养要求较高的细菌,如肺炎链球菌感染方面有优势。

表1 比较宽范围PCR和普通培养的试验结果

图3 黏质沙雷菌测序结果

讨论

临床无菌体液(血液、脑脊液、胸腹水、关节液)感染症状严重,病情进展迅速,如果不能快速诊断,并给予正确治疗,病死率极高。而目前临床上诊断无菌体液感染主要依赖直接涂片镜检和细菌培养。直接涂片阳性率很低,因为初期的无菌体液感染时往往达不到涂片阳性所需的浓度,所以细菌培养仍然是诊断细菌感染的经典方法,不仅因为其敏感性高、特异性强,而且可以进行体外药物敏感试验,为目前临床抗感染治疗提供依据。然而,普通培养多需要48 h以上,而药物敏感试验结果更需要72 h以后才能发出报告,极大限制了临床实验室检验结果的应用,因为无菌体液如血液感染一般病情进展迅速,临床医生不会等到检验结果发出以后再进行用药,往往在培养结果发出之前就进行经验治疗,而大量广谱抗菌药物的应用又会导致细菌耐药率呈逐年上升的趋势,使以后的治疗变得更加艰难。所以目前急需能够快速进行病原学诊断的方法出现,分子生物学的发展使人们看到了希望,如Kotilainen等[ 5]和Xu等[ 6]的研究表明,在急性脑膜炎时,使用特异性PCR可以早期快速进行某些病原学诊断,也可以通过分子生物学的方法检测某些耐药基因,从而为临床用药提供帮助[ 7]。但美中不足的是,该方法需要对每一种细菌都设计一种特异性引物,而临床病原体来源复杂,不可能对每一个标本都应用多种引物来扩增,从而大大局限了PCR在检测临床病原体方面的应用,除非临床实验室工作人员高度怀疑某一细菌感染时,才用PCR来验证。宽范围PCR是新近开发出应用于病原学诊断的方法,通过扩增细菌保守的16S rRNA和测序,可以将病原微生物鉴定到种。本研究通过收集高度怀疑感染的无菌体液94例,同时使用宽范围PCR和培养2种方法进行检测,从而对宽范围PCR应用于临床感染检测的敏感性、特异性进行比较。本研究结果可以为宽范围PCR应用于临床无菌体液感染检测提供理论依据。

通过反复试验,本研究建立了稳定的宽范围PCR体系,并根据该体系扩增临床无菌体液94例,其中宽范围PCR阳性的结果15例,通过将PCR结果测序可以直接鉴定到种。而利用培养技术检测到阳性9例。通过比较2种方法的结果得知,宽范围PCR具有更高的敏感性(15/94),并且其结果和经典培养技术具有较高的一致性。因为利用培养技术检测到的9例阳性标本中,宽范围PCR均检测阳性,并且测序鉴定到种后结果和培养结果完全吻合。而在培养阴性的标本中,利用宽范围PCR可检测到6例阳性标本,分别为4例血液中检测到铜绿假单胞菌、1例胸腹水中检测到黏质沙雷菌、1例脑脊液中检测到肺炎链球菌。分析这6例标本信息时发现,4例血液标本在送培养前均使用过抗菌药物治疗,说明宽范围PCR在检测使用过抗菌药物的标本时,比培养技术具有更高的敏感性。且6例培养阴性而宽范围PCR阳性的标本中,有1例为肺炎链球菌,提示宽范围PCR在检测苛养菌方面同样具有优势。需要注意的是,该方法虽然具有较高的敏感性和特异性,同时也伴随较高的假阳性率。因为PCR本身敏感性高,如果标本有污染或在操作过程中被污染,均可得到假阳性的宽范围PCR结果。解决此问题的关键是,除了整个试验过程中严格无菌操作之外,每次试验均要做宽范围PCR阴性对照,如果阴性对照也可以扩增出条带,即代表本批试验失败,需重新进行试验。

由以上得知,本研究建立了稳定的宽范围PCR体系。该技术敏感性高,其结果和培养结果具有很好的一致性。并且在诊断使用过抗菌药物的患者标本和苛养菌感染时,具有更好的优越性。所以该方法有望成为检测临床无菌体液感染的新方法。但由于本研究标本量小,设计简单,可能还需要进一步更加深入的研究,才能得出更加令人信服的结果。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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