引用本文
赵文杰, 岑岭. 荧光原位杂交检测多发性骨髓瘤患者13号染色体缺失和IgH基因易位. 26(12): 861-864
ZHAO Wenjie, CEN Ling. Detection of the deletion of chromosome 13 and the translocation of immunoglobulin heavy chain gene by interphase fluorescence in situ hybridization in patients with multiple myeloma. Labratory Medicine, 26(12): 861-864  
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荧光原位杂交检测多发性骨髓瘤患者13号染色体缺失和IgH基因易位
赵文杰, 岑岭
常州市第二人民医院检验科,江苏 常州 213003

作者简介:赵文杰,男,1971年生,主管技师,主要从事血液学检验工作。

摘要
目的

分析多发性骨髓瘤(MM)患者13号染色体长臂缺失[del(13q)]和免疫球蛋白重链(IgH)基因易位[t(14q)]与临床相关因素的关系。

方法

采用间期荧光原位杂交(FISH)技术对25例初诊MM患者应用探针D13S319、IgH分别进行del(13q)和t(14q)的检测。

结果

25例患者中del(13 q)8例(32.0%)、IgH易位4例(16.0%),同时存在上述2种异常2例(8.0%)。伴del(13 q)及IgH易位的患者具有较高的血清β2-微球蛋白(β2-MG)水平及较高的骨髓浆细胞百分比。

结论

间期FISH是一种检测MM患者骨髓瘤细胞突变的敏感方法,具有临床应用价值。del(13q)、t(14q) 对判断临床疗效和预后具有指导作用。

关键词: 多发性骨髓瘤; FISH; 13号染色体; IgH基因; 临床应用
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0861-04
Detection of the deletion of chromosome 13 and the translocation of immunoglobulin heavy chain gene by interphase fluorescence in situ hybridization in patients with multiple myeloma
ZHAO Wenjie, CEN Ling
Department of Clinical Laboratory,Changzhou Second People's Hospital, Jiangsu Changzhou 213003,China
Abstract
Objective

To investigate the relationship of the deletion of the long arm of chromosome 13[del(13q)]and the translocation of immunoglobulin heavy chain (IgH) gene[t(14q)]in multiple myeloma(MM) patients with related clinical factors.

Methods

The interphase fluorescence in situ hybridization(FISH) was performed in 25 primarily-diagnosed MM patients to detect del(13q)and t(14q) with probe D13S319 and IgH.

Results

The positive rates of del(13q)and t(14q)were 32.0% and 16.0% in 25 MM patients.Two patients(8.0%)had both 2 abnormalities of them. The patients with the 2 abnormalities had higher beta2-microglobin (β2-MG) level and bone marrow plasma cell percentage.

Conclusions

Interphase FISH is a sensitive method to detect the mutation of MM. The del(13q) and t(14q) can be used to predict treatment response and prognosis.

Keyword: Multiple myeloma; Fluorescence in situ hybridization; Chromosome 13; Immunoglobulin heavy chain gene; Clinical application

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积累为特征的肿瘤,有明显的异质性,预后差异很大。而骨髓瘤浆细胞的有丝分裂活性低,用常规细胞遗传学方法往往难以获取足够的分裂相进行分析,且只能在30%~50%的患者中发现克隆性染色体异常[ 1]。近年来,随着荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)的应用,已发现MM 几乎涉及人类所有染色体异常。尤其经常发生位于染色体13q14的D13S319位点缺失[del(13q)]和14q32的免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain,IGH)基因易位[t(14q)][ 2~4]。已有研究资料证实,部分伴此类染色体异常的MM患者常规剂量化疗后生存期短、预后差[ 5]。我们采用间期FISH技术对25例MM患者进行del(13q)和t(14q)的检测,并评价这2种突变以及各项血清学指标与疗效的关系,旨在筛选有效预测MM预后的指标。

材料和方法
一、对象

2006年8月至2009年3月在常州市第二人民医院血液科住院的25例MM患者,诊断标准参照《血液病诊断与疗效标准》[ 6]。所有患者均为初诊,其中男14例、女11例,年龄39~89岁。根据Durie和Salmon分期系统进行疾病分期,25例患者中Ⅰ期1例、Ⅱ期3例、Ⅲ期21例。

所有患者均进行血清β2-微球蛋白(β2-MG)检测及骨髓、染色体常规核型分析。以5例明确诊断的巨幼细胞性贫血患者作为对照组。

二、方法

1.标本采集 每例MM患者在完成常规骨髓穿刺涂片后,无菌条件下抽取骨髓10 mL。用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,以(1~2)×106/mL的密度接种于25 mL培养瓶中,培养基为含20%小牛血清的RPMI1640。添加白细胞介素-6(IL-6)(终浓度10 ng/mL),72 h后加入秋水仙酰胺,37 ℃孵育4 h后收获细胞,按直接法步骤获取细胞悬液[ 7]。

2.FISH (1)探针及试剂:均购自北京金菩嘉科学技术有限公司。位点特异性探针(LSI)D13S319单色探针检测13号染色体长臂缺失;LSI IGH断裂重排双色探针检测IGH基因易位;(2)操作方法:杂交前1 d滴片,室温老化过夜。相差显微镜下观察,划定杂交区域。按照探针试剂说明书进行DNA变性、杂交、洗片及复染。(3)信号检测:荧光显微镜为日本Olympus公司产品, ISH图像分析系统为俄罗斯VideoTesT公司产品。LSI D13S319探针在正常间期细胞中表现为2个红色信号(2R),只有1个信号时(1R)判断为阳性。(见 图1)。LSI IGH断裂重排探针在正常间期细胞中表现为2个黄色融合信号(2F),出现相互分离的红色信号、绿色信号和1个黄色融合信号(1RlGlF)时判断为阳性。(见 图2)。分析每例正常对照标本的200个间期细胞,计算出现阳性信号的百分率及其均值( )和标准差( s),以 +3 s作为截断值[ 8]。分析每例MM患者骨髓瘤细胞标本的200个间期细胞,计算出现阳性信号的百分率,超过截断值者判定为阳性。每例标本均进行重复性实验,重复2次。

图1 13号缺失(仅见1个红色信号)

图2 13号正常(2个红色信号)

三、统计学方法

应用SPSSl3.0软件进行分析。计量资料以 ±s表示,经正态性分析和方差齐性分析后,2组间比较采用 t检验。计数资料以率表示,2组间比较采用Fisher精确概率检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、对照组

5例对照组与D13S319探针和LSI IGH断裂重排探针杂交的阳性率分别为6.25%±2.11%和4.95%±2.28%。因此发生del(13q)和t(14q)的临界值分别为12.58%及11.79%。

二、实验组

25例MM患者中del(13 q)8例(32.0%)、IgH易位4例(16.0%)、同时存在上述2种异常2例(8.0%)。

三、临床因素分析

以25例MM患者骨髓浆细胞平均值为界进行确切概率法分析, del(13q)、t(14q)与浆细胞水平呈显著相关性。同样以25例MM患者的平均β2-MG水平与不伴异常组进行比较,经确切概率法分析,证实del(13q)、t(14q)与β2-MG水平亦显著相关。同时分析结果显示此两类异常与患者年龄、性别无明显相关性。详细结果见 表1。

图3 IgH重排(1个黄色信号,另1信号重排为1红1绿分开)

图4 IgH未重排(2个黄色信号)

表1 MM患者异常核型与临床参数间的关系
讨论

常规的细胞遗传学方法对于MM的异常核型检出率并不高,这主要与骨髓瘤细胞的增殖率低,细胞周期时间长,以至不能得到足够的中期分裂相有关。用磁珠138对浆细胞进行分选能提高异常核型的检出,但难以在基层医院推广。本研究患者均为初诊患者,本身伴较高的骨髓浆细胞水平。国外报道[ 9]采用细胞因子组合GM-CSF(30 ng/mL)+IL-6(2 000 IU/mL),经细胞因子作用6 d后异常核型检出率显著提高。本研究用了单纯添加IL-6(10 ng/mL)的72 h培养法,能在部分患者中提高异常核型的检出率,同时避免了细胞培养的换液程序,操作上相对比较简单。在此基础上再进行FISH检测,能提高细胞悬液中浆细胞的百分比[ 9]。

FISH技术是在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的,除了可分析中期细胞,还能对间期细胞和终末细胞(如淋巴细胞)进行检测,且不受限于常规显带方法的“盲区”,能对已知序列片段的变化进行高度敏感、特异的检测,能检测出常规显带方法不能发现的异常,显著提高了其识别异常的能力。

由于骨髓瘤细胞有丝分裂指数低,加上骨髓浸润程度不同,常规细胞遗传学方法(CC)染色体异常的检出率只占初诊患者的1/3,del(13 q)的检出率为10%30%。而采用FISH技术能将检出率提高到38%54%[ 10]。本研究del(13q)的异常检出率为32.0%,同文献报道基本相符。对常规细胞遗传学未能检出异常而经FISH检出异常的患者对其治疗效果及预后进行了随访,发现伴有del(13q)、t(14q)易位的患者有着较为不良的预后。可见采用FISH技术能对MM患者的预后进行更为准确可靠的评估。

本研究发现del(13q)、t(14q)与骨髓浆细胞水平及β2-MG水平有显著相关性。这几项都是MM不良的预后因素,这对MM患者的临床疗效和预后均有一定的指导作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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