SELEX技术是由20世纪90年代Tuerk和Gold发展起来的一项新型组合化学技术,利用适体检测其相应的靶物质在疾病的诊断和治疗研究中应用越来越多。由于SELEX技术具有靶分子范围广以及筛选制备方便等优点,筛选的适体与靶分子结合的亲和力和特异性方面可与抗体媲美,且具有抗体所不具备的其他优点,如稳定性好和易于修饰等,在诊断和治疗方面具有独特优势^{[ 4]},目前已被作为一种生物标志应用于各种疾病的诊断和治疗研究中。SELEX技术筛选的核酸适体与靶物质结合呈现高敏感性和高特异性,但该技术也存在很多的技术难点和影响因素,如:(1)一般单链寡核苷酸文库经体外化学随机合成,核苷酸片段太长可导致选择分离的适体概率降低,核苷酸片段太短则库容量太小,不能保证足够的二级结构同靶分子相结合;(2)选择分离适体的方法不同,对分离效率有影响,如高速离心、硝酸纤维素膜过滤、磁性介质分离、凝胶阻滞法、微孔板法、亲和柱层析及毛细管电泳等,其筛选和富集效率不同,过滤和离心法最简便、快速,但因其富集效率低而不适用于小分子和多肽类靶分子的筛选;(3)制备SELEX筛选的单链文库,采用不同方法[如不对称聚合酶链反应(PCR)和生物素链亲和素磁珠法等]均会影响SELEX筛选的过程及效率,因此筛选时需要综合考虑,况且在结核病研究领域,适体作为诊断和治疗试剂尚处于起步阶段。由于适体对环境和体内的多种核酸酶均较敏感,容易降解,且体外筛选的适体在体内可能失去作用^{[ 5]},适体自身很难接近和穿透靶组织,用于体内治疗也存在较多难题。虽然目前尚未见到有关适体不良反应的报道,但其安全性仍需要进一步验证。

近几年来上海市肺科医院一直致力于研究利用SELEX技术筛选能与结核分枝杆菌靶物质特异性结合的寡核苷酸适体,寻找早期诊断结核病的方法^{[ 6~ 8]}。现已筛选获得了结核分枝杆菌IgG抗体的高亲和性适体,建立了以微孔板为筛选介质,生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力的方法。该设计基于较成熟的酶联免疫吸附试验(ELISA)之上,操作简便,易于自动化,具有较好的推广价值。该方法提高了结核病血清学检测的特异性,增加了血清学诊断的准确率,为临床诊断提供了可靠的参考依据,为结核的基础研究、实验室和临床诊疗提供了新的思路和方法。经典抗原抗体ELISA存在一些缺点和不足,如抗原抗体用于ELISA检测主要依赖于体外重组表达,且经过纯化得到的抗原或抗体纯度不高,抗原抗体的天然纯化难以满足临床和实验室诊断的批量需要。核酸适体具有与靶物质亲和性高和特异性强、体外合成方便、纯度高、成本较低、可大批量生产等优点。目前国内尚未见与结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(寡核苷酸酶联免疫法)类似的商品化试剂盒。其检测原理为:用结核分枝杆菌抗体的一种特异性适体作为捕获适体包被酶联板,待检血清中的结核分枝杆菌抗体与捕获适体反应,再与酶标试剂进行二次孵育,形成“适体-抗体-酶标”复合物,后者与复合物上连接的辣根过氧化物酶(HRP)催化显色剂反应,生成蓝色产物,终止反应后变成黄色。若样本中无结核分枝杆菌IgG抗体时,不显色。

本研究中结核分枝杆菌IgG抗体检测诊断结核病的总体敏感性为48.4%,高于文献[7]报道的结果,但低于国内大多数文献^{[ 911]}报道的结果;总体特异性为92.0%,高于国内大多数文献^{[ 9, 11]}的报道结果,但低于文献[7,10]报道的结果。血清特异性抗体检测作为辅助诊断结核病的一种方法,在国内已有很多报道^{[ 611]}。各文献报道的敏感性和特异性也相差较大,其原因可能与结核病病程不同时间及所应用的抗原不同有关^{[ 12]},也可能与检测样本的数量不同及检测的方法学不同有关。本研究特异性较高,因为所用的适体是针对结核分枝杆菌IgG抗体反复筛选获得的,亲和性和特异性均应较高;敏感性一般,可能与IgG抗体结合的只是抗体的一个表位有关。敏感性和特异性在血清学诊断中总是互相矛盾,敏感性很高则特异性往往不高,特异性很高而敏感性往往又不高。本研究所用的结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒较好的解决了这一对矛盾,使其检测具有极高的特异性(92.0%)及较高的敏感性(48.4%),特别是在健康志愿者中的特异性达95.9%,可用于健康人群的初筛。本研究中菌阳肺结核患者的阳性检出率为67.7%,明显高于菌阴肺结核患者阳性检出率(33.5%, χ²=11.21, P<0.01),可能是菌阳患者体内含有大量的结核分枝杆菌,使人体免疫系统更容易受到结核分枝杆菌抗原的刺激,引起比较强的免疫反应。

国外ELISA试剂通常定义一段“灰区”的检测范围,结果报告“可疑”。而国内很少有厂家对结核抗体的灰区进行设定,且各实验室对其观点不一,有的设定在0.9~1.1倍的Cut-off值区域,有的设定在Cut-off值以下15% 的范围。考虑到检测的误差,一般把Cut-off值上下的10%15%的范围定义为灰区。本研究结果的阴性对照平均 A值为0.119,计算其Cut-off值为0.125(0.119+0.06),则样本 A值 ≥ 0.125为结核抗体阳性,样本 A值<0.125为结核抗体阴性。若以Cut-off值上下的10%15%的范围为灰区,本研究中结核病组有16例样本的检测结果处于灰区,按照样本 A值 ≥ 0.125为结核抗体阳性,则报告5例阳性、11例阴性;非结核病其他肺部疾病组中有3例处于灰区,结果报告1例阳性、2例阴性;在健康人群中有2例处于灰区,结果报告1例阳性、1例阴性。处于Cut-off值周围亦即“灰区”结果的可靠性通常较差,阳性当然需要确认,阴性却也未必是真,必须引起注意,对于灰区样本,应对同一血清进行重复试验,重测以确定其阴阳性,如仍落在灰区范围内则报告阳性或对同一患者24周后再留取血清样本进行检测,以排除偶尔的误差,尽量减少假阳性和假阴性。

本研究结核分枝杆菌IgG抗体的阳性检出率为48.4%,高于细菌学阳性检出率(43.5%),但差异无统计学意义( P>0.05)。这可能与本研究的样本数量较少有关。样本数量较少两者的差异还不明显,若扩大研究的样本数量,两者差异会更明显。由于抗体水平与病情变化呈正相关,本研究的样本均来自住院患者,大部分患者均处于治疗中,并有不同程度好转,有些患者病变处于相对稳定状态,因此抗体检测可能出现阴性结果,还有一部分患者处于窗口期(即感染早期抗体尚未形成之前),抗体检测也可以出现阴性结果。虽然本研究中这2种方法的阳性检出率还看不出显著差异,但IgG抗体检测较传统涂片、培养方法操作简便、快速、经济、重复性好,这是毋庸置疑的。

在非结核病其他肺部疾病组中有5例、健康人群中有2例出现ELISA抗体阳性结果,即假阳性结果,其原因可能为中国四川是结核病高感染地区,受试者在此地区生活,不能排除自然感染或人为感染,造成血液中抗结核抗体存在的可能,但目前没有发病。对于这部分患者或健康人,我们将继续跟踪观察。

评价一个试验在临床上的诊断价值依赖于其阳性预测值和阴性预测值^{[ 13]}。特定社区,阳性预测值和阴性预测值随疾病的流行程度而有显著变化^{[ 14]}。在结核病低流行区,阴性预测值高时,如果检测结果是阴性就可以排除结核病;如果在结核病高流行区,阳性预测值高,阳性检测结果有利于临床可疑患者的诊断。本研究中结核病占76.6%,结核分枝杆菌IgG抗体检测诊断结核病的整体准确度为58.6%,阳性预测值为95.2%。中国四川是结核病高流行的地区,这说明本研究的阳性结果具有很高的可信度,对临床医生高度怀疑而又无法确诊的患者有很重要的参考价值。

总之,结核分枝杆菌IgG抗体寡核苷酸酶联免疫法有较高的特异性及一定的敏感性,可用于结核分枝杆菌IgG抗体的血清学检测。该方法提高了结核病血清学检测的特异性,增加了血清学诊断的准确率,为临床治疗提供了可靠的参考依据。