引用本文
闫佩毅, 张文龙, 张骥, 朱元, 王旋, 邹玉涵, 金姝, 朱晴晖. 流式细胞术检测抗中性粒细胞抗体方法的建立及临床初步应用. 26(12): 826-831
YAN Peiyi, ZHANG Wenlong, ZHANG Ji, ZHU Yuan, WANG Xuan, ZOU Yuhan, JIN Shu, ZHU Qinghui. Establishment of the anti-neutrophil antibody detection by flow cytometry method and its primary clinical application. Labratory Medicine, 26(12): 826-831  
Permissions
Copyright©2011, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
流式细胞术检测抗中性粒细胞抗体方法的建立及临床初步应用
闫佩毅1, 张文龙2, 张骥3, 朱元3, 王旋3, 邹玉涵1, 金姝1, 朱晴晖1
1.上海市普陀区人民医院中心实验室,上海 200060
2. 上海市普陀区人民医院血液科,上海 200060
3.上海市普陀区人民医院检验科,上海 200060

通讯作者:朱晴晖,联系电话:021-32274550-2502。

作者简介:闫佩毅,女,1982年生,硕士,技师,主要从事免疫学和分子生物学基础与临床应用研究。

摘要
目的

建立适用于临床的流式细胞术(FCM)检测抗中性粒细胞抗体(ANA)的方法,并作临床初步应用。

方法

采用FCM,以前向散射和侧向散射参数区分全血标本中的淋巴细胞和粒细胞,设定粒细胞门,用CD16b-藻红蛋白(PE)和CD177-别藻蓝蛋白(APC)单克隆抗体分别检测中性粒细胞中表面表达CD16b和CD177抗原细胞的百分率。用所建方法检测健康对照32名,确定参考范围,以此作为判断受检者血液中抗CD16b或CD177抗体存在与否的依据。检测外周血白细胞(WBC)总数<4.0×109/L且中性粒细胞绝对计数(ANC)<2.8×109/L的59例患者的CD16b和CD177百分率,并对其中中性粒细胞表达CD16b和/或CD177百分率低于参考范围(即判为相应抗体阳性)的患者给予激素治疗,观察疗效。

结果

健康人群中性粒细胞中表达CD16b和CD177的百分率分别为98.36%±1.53%和74.95%±11.07%,据此分别确定了健康人群中性粒细胞表达CD16b和CD177的参考范围分别为CD16b>95.36%、CD177>53.25%(即>-1.96s)。59例患者中有23例(39.0%)ANA阳性,其中ANC<2.0×109/L患者的ANA阳性率(50.0%)远高于ANC>2.0×109/L患者(27.6%)。ANA阳性患者经激素治疗后,WBC和ANC上升。

结论

FCM检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体是自身免疫性中性粒细胞减少症(AIN)实验简便、快捷的诊断方法,有助于AIN的诊断、鉴别诊断和疗效判断。

关键词: 抗中性粒细胞抗体; 流式细胞术; 自身免疫性中性粒细胞减少症
中图分类号:R392.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0826-06
Establishment of the anti-neutrophil antibody detection by flow cytometry method and its primary clinical application
YAN Peiyi1, ZHANG Wenlong2, ZHANG Ji3, ZHU Yuan3, WANG Xuan3, ZOU Yuhan1, JIN Shu1, ZHU Qinghui1
1.Experimental Center, Shanghai People's Hospital of Putuo District, Shanghai 200060, China
2.Department of Hematology,Shanghai People's Hospital of Putuo District, Shanghai 200060, China
3.Department of Clinical Laboratory, Shanghai People's Hospital of Putuo District, Shanghai 200060, China
Abstract
Objective

To establish the flow cytometry method (FCM) for detecting anti-neutrophil antibody (ANA) and primarily apply it for testing ANA in patients with neutropenia.

Methods

Lymphocyte and granulocyte in whole blood were distinguished by forward scatter and side scatter parameters by FCM, and the granulocyte gate was set up. CD16b and CD177 antigens on neutrophil surface in whole blood samples were detected by CD16b-phycoerythrin (PE) and CD177-allophycocyanin (APC) monoclonal antibody respectively. The whole blood samples from 32 healthy subjects were detected by the established method to determine the reference ranges of CD16b and CD177, which was the basis to judge if the anti-CD16b or anti-CD177 antibodies existed in blood. The whole blood samples' percentages of CD16b and CD177 from 59 patients with white blood cell (WBC) count <4.0×109/L and absolute neutrophil count(ANC) <2.8×109/L were detected by the method. The patients with CD16b and/or CD177 on neutrophil expression below the reference ranges (the corresponding antibody positive) were treated with hormone in order to the curative effect observation.

Results

The percentages of CD16b and CD177 expression on neutrophil in healthy controls were 98.36%±1.53% and 74.95±11.07%, and the reference ranges of the CD16b and CD177 expression on neutrophil were >95.36% and 53.25% (-1.96s), respectively. The 23(39.0%) of 59 patients were ANA positive, and the positive rate of ANA in the patients with ANC <2.0×109/L (50.0%) was higher than that in the patients with ANC >2.0×109/L (27.6%).The WBC and ANC of the patients with ANA positive were elevated after hormone therapy.

Conclusions

The FCM for detecting anti-neutrophil CD16b and CD177 antibodies is simple, fast and well applicable for the laboratory diagnosis and curative effect observation of autoimmune neutropenia (AIN).

Keyword: Anti-neutrophil antibody; Flow cytometry; Autoimmune neutropenia

自身免疫性中性粒细胞减少症(autoimmune neutropenia,AIN)是一组由自身抗中性粒细胞抗体(antineutrophil antibody,ANA)引起的疾病,包括粒细胞减少[10岁以下儿童外周血中性粒细胞绝对计数(absolute neutrophil count,ANC)<1.5×109/L,成人<2.0×109/L]和中性粒细胞缺乏(ANC<0.5 ×109/L)。AIN的诊断依据以在患者体内检出特异性ANA最为确凿[ 1]。现有的多种检测ANA的方法中,粒细胞免疫荧光试验(granulocyte immunofluorescence test,GIFT)和粒细胞凝集试验(granulocyte microagglutinaion test,GAT)联合试验是国际粒细胞血清学工作组(1997年)推荐的方法[ 2],但因受其用血量大、手工操作繁复且很难重复等的限制,在临床难以推广应用[ 3],以致在AIN的诊断上除明确规定的中性粒细胞减少的标准辅以骨髓检查(骨髓象多呈增生象伴粒细胞系“成熟障碍”或“纯白细胞再生障碍性贫血”)外[ 4],主要采取的是除外诊断,凸显AIN试验诊断发展的滞后。临床需要一种简单快速、用血量小、可重复的试验方法。流式细胞术(flow cytometry, FCM)与传统的检测方法相比,具有速度快、用血少、精度高、准确性好等优点。FCM通过前向散射与侧向散射参数确立粒细胞门,省去其他方法需分离粒细胞的繁杂步骤;且用针对中性粒细胞表面不同抗原的单抗,一次可以标记多种抗原,减少试验步骤。已知CD16b和CD177代表了中性粒细胞的胞膜上最主要的免疫原性分子,是AIN中高频出现的自身抗体的靶抗原[ 5]。我们选用CD16b和CD177作为检测AIN的靶抗原,以中性粒细胞表面CD16b和/或CD177检出的百分率作为判断受检者血液中抗CD16b或CD177抗体存在与否的依据[ 3]。

材料和方法
一、试剂和仪器

单克隆抗体:别藻蓝蛋白(APC)标记小鼠抗人CD177(IgG1)(克隆号:MEM-166;Catalog No:ab77230) 由香港Abcam公司生产,同型对照APC标记小鼠IgG1(克隆号:X40;Catalog No:340442)、藻红蛋白(PE)标记小鼠抗人CD16b(IgG2a.κ)(克隆号:CLB-gran 11.5;Catalog No:550868)、同型对照PE标记小鼠IgG2a.κ(克隆号:G155-178;Catalog No:555574)、溶血剂(Lysing Solution)和缓冲液(FASC Flow)均由美国Becton-Dickinson(BD)公司生产。所用仪器为美国BD公司FACS Calibur型流式细胞仪。

二、标本来源

1.健康对照组 选取上海市普陀区人民医院健康体检人员32名,男18名,女14名,年龄21~56岁,外周血白细胞(WBC)计数为(5.99.9)×109/L,中性粒细胞百分率为53.0%~68.7%。

2.患者组 2010年3月至2011年7月期间来上海市普陀区人民医院血液科就诊的患者59例,男11例,女48例,年龄17~87岁,WBC<4.0×109/L且ANC<2.8×109/L,有药物反应、化学中毒、电离辐射和感染等除外。

三、方法

1.FCM检测 采集静脉血2 mL,用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝,各吸50 μL全血于2支Falcon管。第1管加入同型对照抗体;第2管为测定管,加入CD16b-PE 抗体10 μL、CD177-APC抗体5 μL。混匀试剂和抗凝血,在室温避光温育20 min后每管加入500 μL溶血剂,混匀后室温避光静置10 min。1 500 r/min(离心半径5 cm)离心5 min,弃上清并加入磷酸盐缓冲液(PBS) 1 mL,混匀,1 500 r/min(离心半径5 cm)离心5 min,弃上清再加入PBS 300 μL重悬,上流式细胞仪检测。利用侧向散射光(SS)和前向散射光(FS)选取粒细胞群(设门R1),检测细胞表面表达CD16b和CD177的百分率。数据经Cell Quest软件获取和分析,每个标本每次检测10 000个细胞。

2.参考范围确定 计算健康对照组的中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率均值( )和标准差( s),定义CD16b> -1.96 s、CD177> -1.96 s为参考范围,中性粒细胞表面CD16b或CD177百分率低于参考范围判为相应抗体阳性。

3.患者检测 用所建方法测定59例中性粒细胞低下患者EDTA-K2抗凝全血标本中的中性粒细胞表面CD16b和CD177的表达百分率,并与参考范围比较,以此判断受检者血液中是否存在抗CD16b和CD177抗体。

结果
一、健康对照组中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率

32名健康对照者中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率见 表1,CD16b =98.36%、 s=1.53;CD177 =74.95%、 s=11.07。由 表1数据确定CD16b和CD177抗原表达的参考范围(> -1.96 s):CD16b>95.36%,CD177>53.25%。 图1显示了1名健康对照者FCM检测结果。

表1 32名健康对照者中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率(%)

图1 FCM检测健康对照者CD16b和CD177抗原散点图和直方图

二、WBC<4.0×109/L且ANC<2.8×109/L患者组检测结果

在WBC<4.0×109/L的患者中,ANC<2.0×109/L的患者检出中性粒细胞表达CD16b和/或CD177百分率低于参考范围的比例为50.0%(15/30),远高于ANC>2.0×109/L患者的检出率[27.6%(8/29)],见 表2。 图2和 图3分别为抗CD16b抗体阳性和抗CD177抗体阳性患者FCM检测的散点图。

表2 ANC低下患者的ANA检出率[例(%)]

图2 FCM检测CD177抗体阳性患者抗原散点图和直方图

图3 FCM检测CD16b抗体阳性患者抗原散点图和直方图

三、所建方法在临床观察疗效中的初步应用

对中性粒细胞表达CD16b和/或CD177百分率低于参考范围(即判为相应抗体阳性)的患者给予激素治疗(口服强的松15 mg/d,治疗3周)。 表3以2例CD177百分率低于参考范围的患者和1例CD16b百分率低于参考范围的患者为代表,显示激素治疗后患者的WBC和/或ANC明显升高。其中患者2治疗后中性粒细胞中表达CD16b的百分率上升至0.96%(虽有所上升,但仍远低于参考范围),患者3治疗后中性粒细胞中表达CD177的百分率上升至55.93%(已处于参考范围内),该患者的ANC上升亦最显著。

表3 ANA阳性的AIN患者激素治疗前、后WBC和ANC比较
讨论

AIN是一组临床表现呈高度异质性的疾病,从无症状到有高发病率和高死亡率的感染性并发症[ 6]。除具有明显遗传背景的先天性中性粒细胞减少症(congenital neutropenia)[ 7, 8]外,根据诱生ANA的因素不同可分为:因父母的中性粒细胞抗原不相容,导致母体内产生抗中性粒细胞IgG抗体[ 9],或AIN母亲的ANA经胎盘进入胎儿体内[ 10]导致的新生儿AIN;多发于婴儿的原发性AIN[ 6];继发于自身免疫性疾病、恶性肿瘤、感染、病毒性、神经科病等的继发性AIN以及药物与中性粒细胞结合或药物-中性粒细胞免疫复合物导致ANA产生所致的药物性AIN[ 11]。AIN均以抗中性粒细胞的自身抗体为特征,导致中性粒细胞的损伤破坏[ 6]。

有关AIN的病因学和发病机制有多种观点:由于中性粒细胞自身抗体的存在而使中性粒细胞循环加速或中性粒细胞产生受损[ 12, 13];因患者体内存ANA,导致中性粒细胞在外周血或通过脾脏的时候破坏,或由补体介导的中性粒细胞溶解作用使粒细胞减少[ 14];ANA导致巨噬细胞对中性粒细胞的吞噬作用[ 15];AIN的免疫学应答可能在B淋巴细胞产生抗体后由CD4+T细胞触发[ 12]。

AIN的诊断依赖于在患者体内检出抗中性粒细胞的特异性抗体[ 1],确认ANA的靶抗原是建立检测针对中性粒细胞特异性抗原的抗体方法的前提,诸多学者强调了关注中性粒细胞膜表面特异性抗原对改进ANA检测的的重要性。1989年,Rothko等[ 16]用免疫印迹法最早证实人类粒细胞同种抗原(human neutrophil alloantigen,HNA)-1是AIN的靶抗原之一,迄今已确认了分属5个HNA抗原系统的7个HNA,分别是HNA-1系统的HNA-1a、HNA-1b和HNA-1c,HNA-2、-3、-4、-5系统的HNA-2a、-3a、-4a和HNA-5a[ 5]。2001年,以HNA糖蛋白的定位作为命名的基础,国际输血协会粒细胞工作委员会对人类中性粒细胞抗原HNA进行了重新命名,HNA-1糖蛋白即免疫球蛋白Fcγ受体Ⅲb(FcγR Ⅲb),亦即CD(cluster of differentiation)系统中的CD16b,HNA-2糖蛋白即CD177,HNA-4糖蛋白即CD11b。糖蛋白CD16b和CD177是高频出现的ANA的靶抗原,这2种抗原(尤其是CD16b)是中性粒细胞细胞膜上最主要的免疫原性分子,分别代表了临床所见的ANA的最重要靶抗原HNA-1a、-1b、-1c和 HNA-2a[ 17, 18]。测定针对特异性糖蛋白的抗体可以提高检测的特异性。

ANA检测的方法学有多种,如GIFT、GAT、粒细胞间接免疫荧光试验(granulocyte indirect immunofluorescence test,GIIFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体粒细胞抗原特异性免疫固定法(monoclonal antibody-specific immunobilization of granulocyte antigen,MAIGA)等[ 4]。学者们报道GAT、GIIFT、GIFT和MAIGA的敏感性和特异性各有不同[ 1719]。GIFT和GAT虽然是推荐方法,但由于需手工分离制备中性粒细胞悬液,过程复杂且需要大量细胞,而AIN患者由于中性粒细胞减少,检测所需的血标本量过大,而且粒细胞寿命短,在体外易激活,不能长久储存。分离和储存新鲜粒细胞是操作上的难点,此外可能还存在假阴性和假阳性结果,这些都阻碍了GIFT和GAT在临床上的常规开展[ 3]。国内范自力等[ 20]曾用自行制备的抗血清和发光剂标记的二抗建立固相竞争化学发光免疫试验检测粒细胞抗体,检测时需经粒细胞分离,藉发光光度仪逐管及时记录发光强度,其操作的繁复使临床推广应用受限。

近年多种FCM用单克隆抗体的制备成功和多种荧光素的应用及其商品化,使FCM检测ANA可能成为一种新的临床检测手段。Wikman等[ 21]用GIFT、间接免疫荧光(indirect immuno-fluorescence,IIF)和FCM检测相同标本后比较各方法的结果证实,FCM可以作为检测特异性ANA的常规技术。周国忠等[ 22]用FCM检测中性粒细胞减少症患者血清中的粒细胞相关免疫球蛋白,因未结合中性粒细胞特异性抗原簇进行分析,特异性欠佳,方法欠成熟。袁燕等[ 23]报道用全血FCM检测粒细胞抗体,选择CD16作为中性粒细胞上的代表性抗原,不仅在抗原的选择上有误(HNA-1应为CD16b,而非CD16),而且遗漏了中性粒细胞上的重要的HNA-2a抗原CD177(本研究结果提示在AIN患者中,抗CD16b与抗CD177的检出率几乎相当),加之病例数仅为31例,尚不能对这一方法的临床价值作出确切的评价。

本研究关注针对HNA-1(CD16b)和HNA-2(CD177)的ANA导致的成人AIN。通过FCM检测中性粒细胞表面CD16b和CD177部分抗原被相应自身抗体封闭后表现出相应抗原表达百分率下降,来间接推断抗CD16b和CD177自身抗体的存在,并确立了中性粒细胞表达CD16b和CD177抗原的百分率参考范围,为临床应用奠定了基础。在参考范围建立的过程中发现有些WBC和ANC均正常的健康人的CD16b或CD177抗原表达远低于正常范围,或根本不表达,这可能与其特殊的遗传背景有关。Wang等[ 24]曾证明台湾儿童AIN在遗传学上与HLA-DQB1*0503有很大的关系。

在随机检测的59例WBC<4.0×109/L且ANC<2.8×109/L患者中共检出23例存在ANA(39.0%),其中30例ANC<2.0×109/L患者中共检出20例存在ANA(50.0%)。虽本研究选用AIN的优势靶抗原CD16b和CD177,并未全面覆盖AIN患者ANA所有的靶抗原,因而尚不能完全反映该组患者ANA的实际阳性率,但也说明在AIN,尤其是ANC<2.0×109/L患者中具有较高的ANA阳性率(若扩大靶抗原的范围,阳性率可能会更高)。其中ANC<2.0×109/L患者中ANA的阳性率(50.0%)显著高于ANC>2.0×109/L患者的阳性率(27.6%)。提示在临床应用中,ANC<2.0×109/L患者更有必要检测ANA以明确AIN的病因。

Ghnaya等[ 25]报道,1例严重的慢性原发性AIN连续2份标本ANA阳性,用环孢霉素治疗,使AIN患者的ANC从0.39×109/L升至1.97×109/L。本研究对本组患者ANA阳性者给予强的松治疗后,WBC和中性粒细胞百分率及ANC均明显上升,提示这些患者激素治疗有效,进一步印证了该患者ANA的存在。

在受检患者中,有1例巨幼细胞性贫血患者在多次输血后,中性粒细胞中CD16b抗原的表达率从正常降至极低的0.69%,可证明同种异体输血可产生ANA,提示临床应严格执行输血指征,避免诱生某些自身抗体。

必须指出,在诊断AIN过程中1次粒细胞抗体阴性并不能排除AIN,需多次重复检测粒细胞特异性抗体才能确诊。因此需多次重复检测ANA,并尽量扩大所测靶抗原的种类,并注意结合临床予以鉴别诊断和治疗。Bruin等[ 19]发现,在AIN早期,可测得抗FcRⅢb(即CD166)特异性抗体,在全病程中都可测到HNA-1a 或 HNA-1b抗体,提示在疾病全程ANA的抗原特异性有变化,有条件时应对AIN的ANA进行追踪检测。

综上所述,FCM检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体的方法简便、快捷。利用本研究所建方法的思路和原理,在确认血小板上的靶抗原的前提下,还可以尝试用FCM检测血小板抗体。Wikman等[ 21]用FCM成功检测靶抗原位于细胞内的ANA,体现了FCM的独特优势。AIN的实验诊断依据以在患者体内检出特异性ANA最为确凿,作为AIN的临床诊断、鉴别诊断和疗效判断的新方法,FCM检测ANA具有良好的临床应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Lamy T. Autoimmune neutropenias[J]. Rev Prat, 2001, 51(14): 1552-1557. [本文引用:2]
[2] Bux J, Chapman J. Report on the second international granulocyte serology workshop[J]. Transfusion, 1997, 37(9): 977-983. [本文引用:1] [JCR: 3.526]
[3] Nguyen XD, Flesch B, Sachs UJ, et al. Rapid screening of granulocyte antibodies with a novel assay: flow cytometric granulocyte immunofluorescence test[J]. Transfusion, 2009, 49(12): 2700-2708. [本文引用:3] [JCR: 3.526]
[4] 林果为, 王小钦. 免疫性粒细胞减少症的诊断及治疗[J]. 中国实用内科杂志, 2006, 26(7): 487-489. [本文引用:2]
[5] Bux J. Molecular nature of antigens implicated in immune neutropenias[J]. Int J Hematol, 2002, 76(Suppl 1): 399-403. [本文引用:2] [JCR: 1.681]
[6] Akhtari M, Curtis B, Waller EK. Autoimmune neutropenia in adults[J]. Autoimmun Rev, 2009, 9(1): 62-66. [本文引用:3] [JCR: 7.975]
[7] Boztug K, Welte K, Zeidler C, et al. Congenital neutropenia syndromes[J]. Immunol Allergy Clin North Am, 2008, 28(2): 259-275. [本文引用:1]
[8] Donadieu J, Fenneteau O, Beaupain B, et al. Congenital neutropenia: diagnosis, molecular bases and patient management[J]. Orphanet J Rare Dis, 2011, 6: 26. [本文引用:1] [JCR: 4.315]
[9] Curtis BR, Reno C, Aster RH. Neonatal alloimmune neutropenia attributed to maternal immunoglobulin G antibodies against the neutrophil alloantigen HNA-1c (SH): a report of five cases[J]. Transfusion, 2005, 45(8): 1308-1313. [本文引用:1] [JCR: 3.526]
[10] Kameoka J, Funato T, Miura T, et al. Autoimmune neutropenia in pregnant women causing neonatal neutropenia[J]. Br J Haematol, 2001, 114(1): 198-200. [本文引用:1]
[11] Frenette A, Perreault MM, Lan S, et al. Thiopental-induced neutropenia in two patients with severe head trauma[J]. Pharmacotherapy, 2007, 27(3): 464-471. [本文引用:1] [JCR: 2.311]
[12] Kumakura S, Kobayashi S. Autoimmune neutropenia[J]. Intern Med, 2003, 42(2): 133-134. [本文引用:2] [JCR: 0.973]
[13] Schwartzberg LS. Neutropenia: etiology and pathogenesis[J]. Clin Cornerstone, 2006, 8(Suppl 5): S5-S11. [本文引用:1]
[14] Ambrose LR, Morel AS, Warrens AN. Neutrophils express CD52 and exhibit complement-mediated lysis in the presence of alemtuzumab[J]. Blood, 2009, 114(14): 3052-3055. [本文引用:1] [JCR: 9.06]
[15] Simpson DM, Ross R. Effects of heterologous anti-neutrophil serum in guinea pigs. Hematologic and ultrastructural observations[J]. Am J Pathol, 1971, 65(1): 79-102. [本文引用:1] [JCR: 4.522]
[16] Rothko K, Kickler TS, Clay ME, et al. Immunoblotting characterization of neutrophil antigenic targets in autoimmune neutropenia[J]. Blood, 1989, 74(5): 1698-1703. [本文引用:1] [JCR: 9.06]
[17] Riera NE, Rosso Saltó M, Galán V, et al. Anti-polymorphonuclear neutrophil antibodies in patients with leukopenia or neutropenia[J]. Int J Lab Hematol, 2010, 32(1 Pt 1): e96-e105. [本文引用:1] [JCR: 1.293]
[18] Manny N, Zelig O. Laboratory diagnosis of autoimmune cytopenias[J]. Curr Opin Hematol, 2000, 7(6): 414-419. [本文引用:1] [JCR: 4.111]
[19] Bruin M, Dassen A, Pajkrt D, et al. Primary autoimmune neutropenia in children: a study of neutrophil antibodies and clinical course[J]. Vox Sang, 2005, 88(1): 52-59. [本文引用:1] [JCR: 2.847]
[20] 范自力, 王成红, 戴朝晖. ITP伴免疫性粒细胞减少症患者外周血中抗粒细胞抗体的检测[J]. 中国医师杂志, 2003, 5(7): 964. [本文引用:1]
[21] Wikman A, Olsson I, Shanwellt A, et al. Detection by flow cytometry of antibodies against surface and intracellular granulocyte antigens[J]. Scand J Clin Lab Invest, 2001, 61(4): 307-316. [本文引用:2]
[22] 周国忠, 叶飞, 胡若愚, 等. 流式细胞仪检测粒细胞抗体在白细胞减少症中的应用[J]. 放射免疫学杂志, 2006, 19(4): 339-341. [本文引用:1]
[23] 袁燕, 谢毅. 全血法流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法建立及临床应用[J]. 诊断学理论与实践, 2004, 3(6): 409-412. [本文引用:1]
[24] Wang LY, Wang CL, Chu CC, et al. Primary autoimmune neutropenia in children in Taiwan[J]. Transfusion, 2009, 49(5): 1003-1006. [本文引用:1] [JCR: 3.526]
[25] Ghnaya H, Bekov K, Jira M, et al. Primary chronic autoimmune neutropenia successfully treated with sirolimus[J]. Rev Med Interne, 2008, 29(11): 940-942. [本文引用:1] [JCR: 0.899]