引用本文
吴洪坤, 周琳, 张玲珍, 仲人前. 强直性脊柱炎患者外周血中B淋巴细胞亚群、B细胞活化因子及其受体的表达研究. 26(12): 818-822
WU Hongkun, ZHOU Lin, ZHANG Lingzhen, ZHONG Renqian. The expression research of B lymphocyte subsets, B-cell activating factor and its receptor BR3 in peripheral blood from patients with ankylosing spondylitis. Labratory Medicine, 26(12): 818-822  
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强直性脊柱炎患者外周血中B淋巴细胞亚群、B细胞活化因子及其受体的表达研究
吴洪坤, 周琳, 张玲珍, 仲人前
第二军医大学附属长征医院实验诊断科 全军临床免疫中心,上海 200003

通讯作者:周琳,联系电话:021-81886079。

作者简介:吴洪坤,男,1982年生,硕士,助理研究员,主要从事免疫检验工作。

基金:国家自然科学基金(30901368); 上海市青年科技启明星计划资助项目(09QA1407400);
摘要
目的

研究强直性脊柱炎(AS)患者外周血中B淋巴细胞亚群、B细胞活化因子(BAFF)及其受体BR3的表达,为进一步探讨AS发病机制提供新的理论依据。

方法

采用流式细胞术测定24例AS患者及30名正常健康体检者外周血中CD19+总B细胞、CD19+CD20+CD27-初始B细胞、CD19+CD20+CD27+记忆性B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞、BAFF及其受体BR3的表达百分率;采用免疫散射比浊法测定AS患者和正常体检者血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM浓度;并分析外周血白细胞BAFF的表达水平与B淋巴细胞亚群百分率、免疫球蛋白浓度之间的相关性。

结果

与正常对照组比较,AS患者的外周血中CD19+总B细胞和CD19+CD38+抗体分泌细胞的表达率、BAFF及其受体BR3的表达比例、血清IgG、IgA浓度均明显升高(P<0.05)。外周血白细胞中BAFF的表达水平分别与外周血白细胞CD19+总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞百分率及血清IgG、IgA浓度呈明显正相关(r=0.695,P=0.000;r=0.610,P=0.002;r=0.813,P=0.000;r=0.665,P=0.000)。

结论

AS患者外周血中存在异常表达的总B细胞、抗体分泌细胞、BAFF及其受体BR3,提示在AS的发病过程中,B淋巴细胞的异常表达及活化可能发挥致病作用。

关键词: ; B淋巴细胞; B细胞活化因子; 强直性脊柱炎; 免疫球蛋白; 流式细胞术
中图分类号:R392.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)12-0818-05
The expression research of B lymphocyte subsets, B-cell activating factor and its receptor BR3 in peripheral blood from patients with ankylosing spondylitis
WU Hongkun, ZHOU Lin, ZHANG Lingzhen, ZHONG Renqian
Department of Laboratory Diagnosis, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract
Objective

To investigate the expressions of B lymphocyte subsets, B-cell activating factor (BAFF) and its receptor BR3 in peripheral blood from patients with ankylosing spondylitis (AS), and provide the reference for the further research of AS pathological mechanism.

Methods

A total of 24 AS patients and 30 healthy subjects were enrolled in the research. The expression percentages of CD19+ total B cells, CD19+CD20+CD27- native B cells, CD19+CD20+CD27+ memory B cells, CD19+CD38+ plasmablast B cells, BAFF and its receptor BR3 were determined by flow cytometry. The concentrations of serum immunological proteins(IgG, IgA and IgM) were determined by nephelometry. The correlation of BAFF expression, B lymphocyte subset percentages and immunological protein concentration was analyzed.

Results

The results showed that the expressions of CD19+ total B cells, CD19+CD38+ plasmablast B cells, BAFF and receptor BR3 and the concentrations of serum IgG and IgA in AS patients were significantly higher than those of healthy controls (P<0.05). The expression of BAFF was correlated with the percentages of CD19+ total B cells, CD19+CD38+ plasmablast B cells, serum concentrations of IgG and IgA (r=0.695,P=0.000;r=0.610,P=0.002;r=0.813,P=0.000;r=0.665,P=0.000).

Conclusions

The aberrant expressions of total B cells, plasmablast B cell, BAFF and receptor BR3 may be involved in the pathogenesis of AS.

Keyword: B lymphocyte; B-cell activating factor; Ankylosing spondylitis; Immunoglobulin; Flow cytometry

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种主要表现为脊柱和关节慢性、进行性病理损伤的自身免疫性疾病,其临床危害严重,但至今该病的发病机制仍未明确[ 1]。目前,虽有研究报道AS患者体内能检测到多种自身抗体[ 2],但在AS的发病过程中,是否存在B淋巴细胞的异常活化,是否出现异常表达的、与B细胞分化发育密切相关的B细胞活化因子(B-cell activating factor,BAFF)尚不清楚。因此,我们检测了AS患者外周血中主要B淋巴细胞亚群、BAFF及其受体BR3的表达,初步探讨B淋巴细胞的表达和活化在AS免疫机制中的作用。

材料和方法
一、研究对象

AS患者24例,男17例,女7例,年龄(35±14)岁,来自第二军医大学附属长征医院住院患者,临床诊断符合1984年修改的AS的诊断标准。正常对照组30名,男22名,女8名,年龄(33±12)岁,来自第二军医大学附属长征医院健康体检者。所有受试对象均知情同意并自愿参加本研究。

二、试剂和仪器

1.主要试剂 藻红蛋白德州红偶联物(ECD)标记的鼠抗人CD19单克隆抗体、藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD20单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD27单克隆抗体、PE标记的鼠抗人CD38单克隆抗体、FITC标记的鼠抗人BAFF单克隆抗体、PE标记的鼠抗人BR3单克隆抗体、ECD标记的鼠抗人IgG1亚型抗体、FITC标记的鼠IgG1亚型抗体、PE标记的鼠IgG2a亚型抗体均购自美国eBioscience公司。

2.主要仪器 Q-PREP标本处理仪、Cytomics FC 500 流式细胞仪及其分析软件(美国Beckman-Coulter公司),KUBOTA 5420台式高速离心机(日本Kubota公司),BN-II全自动生化分析仪(美国DADE Behring公司)。

三、方法

1. 外周血淋巴细胞中主要B淋巴细胞亚群(CD19+总B细胞、CD19+CD20+CD27-初始B细胞、CD19+ CD20+CD27+记忆性B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞)以及BAFF及其受体BR3表达水平的测定 取AS患者及正常健康人的肝素抗凝静脉血100 μL,分别加入ECD-CD19、PE-CD20、FITC-CD27、PE-CD38、FITC-BAFF、PE-BR3单抗各20 μL,另外在同型对照管中分别加入IgG1-ECD单抗、IgG1-FITC单抗、IgG2-PE单抗各20 μL,混匀后室温下避光反应15 min后加入2 mL溶血剂(flow cytometry lysing solution),37 ℃水溶约10 min,待完全溶血后,立即在流式细胞仪上进行检测。每次检测前用荧光微球(flow check)对仪器进行校准,并根据同型对照进行各荧光素之间的补偿调节,排除相互干扰。检测时根据前向角(FSC) 和侧向角(SSC)散射光信号对白细胞进行3群细胞区分(淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞)。其中B淋巴细胞亚群的分析,对淋巴细胞进行设门分析。每次获取设门内细胞10 000个以上,并保存数据。所用仪器为Cytomics FC500流式细胞仪,系统分析软件为CXP2.1(美国Beckman-Coulter公司)。

2.血清免疫球蛋白测定 采用BN-II特定蛋白仪(速率散射比浊法),检测AS组及正常对照组血清IgG、IgM、IgA浓度。

四、统计学方法

测定结果采用 ±s表示,2组间采用 t检验进行分析,各临床参数间的相关分析采用直线相关分析,变量间相关关系采用Pearson相关分析, P<0.05表示差异有统计学意义,采用SPSS13.0统计分析软件分析。

结果
一、AS患者外周血淋巴细胞中主要B淋巴细胞亚群的百分率

与正常对照组比较,AS患者外周血淋巴细胞中CD19+总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞的百分率明显升高( P<0.05),但2组CD19+CD20+CD27-初始B细胞、CD19+CD20+CD27+记忆性B细胞的百分率差异无统计学意义( P>0.05)。结果见 表1、 图1。

表1 AS组、正常对照组外周血淋巴细胞中B淋巴细胞亚群的百分率比较( ±s, %)

图1 AS组、正常对照组外周血淋巴细胞中B淋巴细胞亚群的百分率比较

二、AS患者外周血白细胞表面BAFF及其受体BR3的表达比例

AS患者外周血白细胞表面BAFF及BR3的表达比例分别为8.3%±4.5%、11.3%±3.5%,均明显高于正常对照组(1.4%±0.7%、5.2%±1.7%, P<0.01),见 图2。

图2 AS组、正常对照组外周血白细胞表面BAFF、BR3表达水平的比较

三、AS患者外周血白细胞BAFF-BR3系统表达水平与B淋巴细胞亚群百分率、免疫球蛋白浓度之间的相关性分析

将AS患者外周血白细胞上BAFF-BR3系统的表达水平分别与外周血淋巴细胞中B淋巴细胞亚群(CD19+总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞、CD19+CD20+CD27-初始B细胞、CD19+CD20+CD27+记忆性B细胞)的百分率作相关性分析。结果显示BAFF的表达水平与CD19+总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞的百分率呈明显正相关( r=0.695, P=0.000; r=0.610, P=0.002);BR3的表达水平与BAFF、CD19+CD38+抗体分泌细胞的百分率呈明显正相关( r=0.588, P=0.003; r=0.800, P=0.000),见 图3。同时,将AS患者外周血白细胞上BAFF的表达水平分别与血清IgG、IgA、IgM浓度作直线相关分析,结果显示BAFF的表达水平与血清IgG、IgA浓度之间呈正相关( r=0.813, P=0.000; r=0.665, P=0.000)。

图3 BAFF与BR3、CD19+ 总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞之间的相关性分析

讨论

AS是一种多见于青壮年,进行性发展以侵犯脊柱并累及骶骼关节为主要表现的自身免疫性疾病, 可伴有关节外表现[ 3]。目前该疾病的病因和发病机制尚不明确,但免疫功能紊乱在AS的发病机制中具有重要作用[ 46]。Wright等[ 2]研究发现在AS患者体内可检测到多种自身抗体,提示B淋巴细胞可能在AS的致病机制中发挥一定作用。

在许多自身免疫性疾病中,B淋巴细胞在致病过程中发挥着异常过度增生或者产生自身抗体等作用,如系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞中初始B淋巴细胞、记忆性B淋巴细胞、抗体分泌细胞亚群表达异常[ 7];在类风湿性关节炎(RA)患者血清中,检测到各种自身抗体的存在[ 8, 9]。本研究对AS患者及正常对照者的外周血淋巴细胞中B淋巴细胞亚群进行了分析,结果发现与正常对照者比较,AS患者外周血淋巴细胞中CD19+总B细胞表达水平升高,CD19+CD38+抗体分泌细胞表达水平升高,这与其他自身免疫性疾病类似,存在B淋巴细胞的异常活化表达。

BAFF是1999年发现的TNF超家族新成员,BAFF主要由单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞产生,作为Ⅱ型跨膜蛋白表达于细胞表面,BAFF共有3种受体,包括BAFF-R、BCMA和TACI。研究表明,在B淋巴细胞增殖活化和功能发挥过程中,BAFF扮演着重要的角色。这些重要的生物学功能包括:明显增强B细胞的成熟、存活、增殖和分化等,维持B细胞稳态及体液免疫平衡[ 1012]。BR3作为BAFF的3种受体之一,与BAFF的结合最特异。通过两者间的相互结合,BAFF广泛参与了增殖、活化和功能的调节[ 13, 14]。通过对研究对象外周血白细胞BAFF及其受体BR3的表达水平进行分析,本研究发现与正常对照者比较,AS患者外周血白细胞上的BAFF及其受体BR3的表达水平均明显升高,且两者之间存在明显正相关。这提示,与RA、多发性硬化、SLE等其他自身免疫病类似[ 15, 16],AS患者外周血白细胞上也存在异常增多的BAFF及受体BR3。

另外,通过对B淋巴细胞亚群百分率与BAFF-BR3系统表达水平的相关性分析,本研究发现外周血白细胞BAFF、BR3表达水平与CD19+总B细胞、CD19+CD38+抗体分泌细胞百分率呈明显正相关,但未发现与CD19+CD20+CD27-初始B细胞、CD19+CD20+CD27+记忆性B细胞存在相关性。同时还发现AS患者的血清IgG、IgA浓度升高,并且与外周血白细胞BAFF及BR3表达水平呈明显正相关。这可能是BAFF与BR3相互作用,加快刺激B细胞活化成熟,作用于初始B细胞向浆细胞分化这一过程,使增加的抗体分泌细胞向细胞外分泌大量的免疫球蛋白或者自身抗体,导致血清中免疫球蛋白浓度显著增加和部分自身抗体产生,同时在炎性组织中造成一定的炎性损伤。这些结果提示,AS患者外周血白细胞中的B淋巴细胞异常活化,表达增加,在表达水平异常增多的BAFF-BR3系统的相互作用下,可能参与了AS患者的病理过程。

综上所述,AS是一种免疫病理机制十分复杂的慢性、进行性自身免疫性疾病;AS患者外周血白细胞表面B淋巴细胞异常表达,以及与BAFF- BR3系统之间的正相关性,为随后AS的免疫病理机制研究提供了一个新的方向。

The authors have declared that no competing interests exist.

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