引用本文
丁秋蕾, 赵建宏, 杨小娜, 梅志琴, 安翠平, 时东彦, 郝小军. 一株产超广谱β-内酰胺酶同时携带qnrB4和aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因大肠埃希菌的鉴定 . 2011, 26(11): 779-783
DING Qiulei, ZHAO Jianhong, YANG Xiaona, MEI Zhiqin, AN Cuiping, SHI Dongyan, HAO Xiaojun. Identification ofEscherichia coli isolate producing extended-spectrum beta-lactamase carriedqnrB4 andaac(6')-Ⅰb-suzhou type genes . Labratory Medicine, 2011, 26(11): 779-783  
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一株产超广谱β-内酰胺酶同时携带qnrB4和aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因大肠埃希菌的鉴定
丁秋蕾1, 赵建宏2, 杨小娜1, 梅志琴3, 安翠平1, 时东彦2, 郝小军1
1.石家庄市中心医院检验科, 河北 石家庄 050011
2.河北医科大学第二医院检验科,河北 石家庄 050000
3.石家庄市传染病医院检验科, 河北 石家庄 050012

通讯作者:赵建宏,联系电话:0311-66002711。

作者简介:丁秋蕾,女,1969年生,硕士,副主任技师,主要从事细菌耐药性监测及耐药机制研究。

基金:石家庄市科技计划项目(10146603);
摘要
目的

了解1株产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)同时携带qnrB4和aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因大肠埃希菌的耐药机制。

方法

采用纸片扩散法检测1株分离于血液标本的大肠埃希菌对19种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)检测6种耐药基因[qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb],并对qnrB、aac(6')-Ⅰb基因测序后进行Blast比对分析。

结果

该菌株除对碳青霉烯类、酶抑制剂复合抗菌药物类敏感外,其余药物全部耐药;PCR发现该菌株同时携带qnrB和aac(6')-Ⅰb基因,经测序并分别与已在美国国立信息中心[NCBI]登录的DQ303921(qnrB4)和EF375621[aac(6')-Ⅰb-suzhou]型比对,同源性均>99%。

结论

该菌株多重耐药的机制与产ESBLs及携带qnrB4和aac(6')-Ⅰb 基因有关。

关键词: 大肠埃希菌; 超广谱β-内酰胺酶; aac(6')-Ⅰb; qnrB
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)011-0779-05
Identification ofEscherichia coli isolate producing extended-spectrum beta-lactamase carriedqnrB4 andaac(6')-Ⅰb-suzhou type genes
DING Qiulei1, ZHAO Jianhong2, YANG Xiaona1, MEI Zhiqin3, AN Cuiping1, SHI Dongyan2, HAO Xiaojun1
1.Department of Clinical Laboratory,Shijiazhuang Central Hospital,Hebei Shijiazhuang 050011, China
2.Department of Clinical Laboratory, the Second Hospital of Hebei Medical University, Hebei Shijiazhuang 050000, China
3.Department of Clinical Laboratory, Shijiazhuang Infection Disease Hospital, Hebei Shijiazhuang 050012, China
Abstract
Objective

To study the resistant mechanisms of producing extended-spectrum beta-lactamase(ESBLs) carriedqnrB4 andaac(6')-Ⅰb-suzhou type genes in a strain ofEscherichia coli.

Methods

The susceptibility of the strain ofEscherichia coli isolated from the blood specimen to antibiotics were detected by disc diffusion method.Six genes [qnrA,qnrB,qnrC,qnrS,qepA andaac(6')-Ⅰb] were identified by polymerase chain reaction(PCR). TheqnrB andaac(6')-Ⅰb genes were sequenced and performed for Blast analysis.

Results

The strain was resistant except to carbapenem antibiotic and complex antibiotic containing inhibitor enzyme. TheqnrB andaac(6')-Ⅰb genes were sequenced by PCR and compared with DQ303921 (qnrB4) and EF375621 [aac(6')-Ⅰb-suzhou] types which were registered in the National Biological Information Center (NCBI).The homology was 99%.

Conclusions

The mechanisms of this multi-drug resistantEscherichia coli are mainly related to ESBLs,qnrB4 andaac(6')-Ⅰb.

Keyword: Escherichia coli; Extended-spectrum beta-lactamase; aac(6')-Ⅰb; qnrB

大肠埃希菌是医院感染的重要病原菌,对常用抗菌药物呈现多重耐药,并常导致严重的医院感染如菌血症、败血症、尿路感染、肺部感染和伤口感染等,临床治疗相当困难。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是大肠埃希菌常见的耐药机制,我们在对139株临床分离的大肠埃希菌研究时发现了1株产ESBLs的大肠埃希菌同时携带 qnrB4、 aac(6') -Ⅰb-suzhou型基因。

材料和方法
一、材料

1.菌株来源 大肠埃希菌(菌株号E07110800291)来自于国家科技部医学微生物资源标准化整理、整合及共享试点项目-临床微生物子课题(河北医科大学第二医院保存,项目编号为2005DKA21202-6),该菌株2007年11月8日分离于河北医科大学第二医院1例胆管癌患者的血液标本,菌株采用法国梅里埃公司的API20E进行鉴定。

2.药敏纸片 所用药敏纸片亚胺培南和美罗培南均为英国Oxoid公司产品;氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟-克拉维酸、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢西丁、复方磺胺甲口恶唑、氨曲南均为北京天坛公司产品。

3.药敏培养基及试剂 水解酪蛋白琼脂培养基为英国Oxoid公司产品;聚合酶链反应(PCR)相关试剂由大连宝生物工程有限公司提供;API20E鉴定条由法国生物梅里埃公司生产。

二、方法

1.药敏试验及ESBLs的检测 药敏试验采用纸片扩散法,ESBLs检测采用头孢他啶和头孢他啶-克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟-克拉维酸纸片做确证试验。两者均按美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2008年标准进行结果判断[ 1]。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)和大肠埃希菌(ATCC 35218),购自卫生部临床检验中心。

2.模板制备 将菌株接种于血琼脂平板,放置孵育箱37 ℃过夜培养。从过夜培养的琼脂平板中,挑取单个菌落放入盛有1 mL Tris缓冲液(pH值8.0)的玻璃管中,配成0.5麦氏浊度,3 000 r/min(离心半径10 cm)离心3 min,取沉淀加200500 μL的蒸馏水,100 ℃煮沸10 min,12 000 r/min(离心半径10 cm)离心2 min,留取上清液作为PCR扩增模板,-20 ℃下冻存。

3.基因检测 根据文献[ 25]报道的方法由上海生工生物工程有限公司合成 qnrA、 qnrB、 qnrC、 qnrS、 qepA、 aac(6')-Ⅰb基因,基因序列见 表1。PCR反应体系为50 μL:10×Buffer缓冲液5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,TaqDNA聚合酶0.25 μL,模板2 μL,双蒸馏水至50 μL混匀。反应条件:放置PCR扩增仪上,94 ℃预变性2 min;93 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环;72 ℃延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果,出现与阳性对照分子相当的目的片段条带为阳性。

表1 引物序列

4.序列测定 aac(6')-Ⅰb、 qnrB扩增阳性基因PCR产物经纯化后,由上海生工生物工程技术有限公司采用ABI PRISM 3730XL自动DNA序列分析仪进行序列测定,所测序列采用GenBank中的BLAST程序进行同源性分析。

结果
一、药物敏感性试验结果

该菌株对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦敏感;对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢西丁、复方新诺明、氨曲南耐药。

二、ESBLs的检测结果

ESBLs为阳性。

三、基因检测结果

PCR检出 aac(6')-Ⅰb、 qnrB基因见 图1,尚未检出 qnrA、 qnrC、 qnrS、 qepA基因。见 图1。

图1 aac(6′)-Ⅰb、 qnrB基因PCR电泳图

四、序列测定结果

qnrB、 aac(6′)-Ⅰb基因PCR产物进行测序,测序结果分别与已在美国国立信息中心[NCBI]登录的GenBanK号为DQ303921( qnrB4)、EF375621( aac(6′)-Ⅰb-suzhou)型比对,同源性>99%,证实为 qnrB4、 aac(6')-Ⅰb-suzhou型,测序图见 图2、3。

图2 aac(6′)-Ⅰb-suzhou型测序图

图3 qnrB4测序图

讨论

1998年, Martínez-Martínez等[ 6]最先报道了质粒pMG252可使细菌对喹诺酮药物的耐药水平提高,并将该喹诺酮类耐药基因命名为 qnr基因(后来更名为 qnrA), qnr基因本身编码的蛋白质不足以引起细菌耐药,其可协同DNA旋转酶、拓扑异构酶IV、细胞外膜孔道蛋白和外排泵等其他耐药机制从而导致耐药菌产生。 qnrS从1株来源于日本的福氏志贺菌中分离出来[ 7],Jacoby等[ 8]在美国和印度发现了 qnrB, qnrB和 qnrS与 qnrA的同源性分别为40%和59%,他们各自编码的蛋白同属于五肽重复家族[ 9]。据统计 qnrB有20个变异体( qnrB1 qnrB20), qnrB4首次由美国学者Robisek等[ 2]在大肠埃希菌中检出;在国内枸橼酸杆菌[ 10]、阴沟肠杆菌[ 11]、产气肠杆菌[ 12]中都有 qnrB4基因检出的报道;本研究中在1株血液标本中检出了 qnrB4,提示 qnr基因参与了这株大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药作用。

2009年Wang等[ 3]从门诊患者的尿标本的奇异变形杆菌中利用pHS10质粒进行转运的方法检出了 qnrC基因; qepA是法国学者Yamane等[ 5]于2007年报道的另一种可介导细菌耐喹诺酮类的质粒基因,其通过对亲水性喹诺酮类药物的外排而介导低水平的耐药。本研究中未检出 qnrC和 qepA基因,这可能与本研究选用的的方法和扩增片段的长度有关。

aac(6')-Ⅰb为氨基糖苷类修饰酶基因, aac(6')-Ⅰb-Cr型、 aac(6')-Ⅰb-Ningbo型、 aac(6')-Ⅰb-suzhou型为其变异基因。 aac(6')-Ⅰb-Cr型由美国学者Robisek等[ 13]报道,其不仅对氨基糖苷类药物有修饰作用,而且对喹诺酮类药物也有修饰作用的新氨基糖苷类修饰酶。国内最早由李智山等[ 14]于2007年在大肠埃希菌中检出;2010年翁幸鐾等[ 15] 从尿液标本中的大肠埃希菌中检出了 aac(6')-Ⅰb-Ningbo型;2007年徐卫东等[ 16]在国内外首次报道从肺炎克雷伯中检出 aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因,2008年黄支密等[ 17]在国内外首次报道从阴沟肠杆菌中检出。本研究中我们在1株产ESBLs的大肠埃希菌中检出了同时携带 qnrB4和 aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因,经检索中文生物医学期刊文献数据库(CMCC)和PubMed数据库,在国内外尚未发现在一株大肠埃希菌中同时检出 qnrB4基因和 aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因的报道。

大肠埃希菌是临床最常见的致病菌之一,随着广谱抗菌药物的大量应用, 及ESBLs、氨基糖苷类修饰酶基因、喹诺酮类耐药基因的出现,使得耐药机制相当复杂。本研究中的E07110800291号大肠埃希菌除对碳青霉烯类、酶抑制剂复合抗菌药物类敏感外,其余药物全部耐药,该菌株对诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星、丁胺卡那、庆大霉素耐药可能与该株菌携带了耐喹诺酮类药物耐药基因 qnrB4和氨基糖苷类药物的耐药基因 aac(6')-Ⅰb-suzhou型有关,该菌株产ESBLs,致使该菌株对第14代头孢菌素类全部耐药,临床治疗非常困难。

有研究表明, qnrA和 qnrB阳性菌株常与产ESBLs(SHV、CTX-M或VE)相关,E07110800291号菌株是否携带这些基因、 qnrB4和 aac(6')-Ⅰb-suzhou型基因是否通过质粒传递有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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