引用本文
彭荣, 金瑞良, 胡忠义. 抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖ELISA的建立及其临床应用. 2011, 26(11): 736-740
PENG Rong, JIN Ruiliang, HU Zhongyi. Establishment of ELISA for lipoarabinomannan fromMycobacterium tuberculosis and its clinical application . Labratory Medicine, 2011, 26(11): 736-740  
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《检验医学》编辑部
抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖ELISA的建立及其临床应用
彭荣1, 金瑞良2, 胡忠义2
1.苏州大学医学部,江苏 苏州 215006
2.上海市结核病(肺)重点实验室, 上海 200433

通讯作者:胡忠义,联系电话:0214-65115006-3037。

作者简介:彭荣,女,1986年生,学士,主要从事微生物和免疫学研究。

基金:国家“十一五”科技重大专项(2008ZX10003003); 上海市卫生局青年基金(2008Y26);
摘要
目的

提取纯化结核分枝杆菌(MTB)脂阿拉伯甘露聚糖(LAM),建立抗LAM抗体(LAM-IgG)检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)。

方法

MTB菌体彻底破碎后,去除蛋白、脂质、核酸,得到粗制的脂多糖。经Sephacryl-100凝胶过滤层析分离纯化,得到LAM。以该LAM作为间接ELISA的包被抗原来检测血清中的LAM抗体。

结果

所得LAM经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)银染,与对照标准品大小一致,为37 000。115例肺结核患者LAM抗体阳性率71.3%;92例非结核肺部疾病患者假阳性率11.9%;188名健康体检者假阳性率3.2%。敏感性71.3%,特异性93.9%。

结论

本研究成功提取到LAM抗原,此抗原可作为间接ELISA的包被抗原用于结核抗体的检测。

关键词: 脂阿拉伯甘露聚糖; 结核分枝杆菌; 抗原; 酶联免疫吸附试验
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)011-0736-05
Establishment of ELISA for lipoarabinomannan fromMycobacterium tuberculosis and its clinical application
PENG Rong1, JIN Ruiliang2, HU Zhongyi2
1.Medical College of Soochow University, Jiangsu Suzhou 215006,China
2.Shanghai Key Laboratory of Mycobacterium Tuberculosis, Shanghai 200433,China
Abstract
Objective

To extract and purify lipoarabinomannan(LAM)fromMycobacterium tuberculosis (MTB) and establish a method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of anti-LAM antibody (LAM-IgG).

Methods

The MTB was crashed. The protein, nucleic acid and lipids were removed, and crude lipopolysaccharides were prepared. The crude lipopolysaccharides were purified by Sephacryl-100 gel filtration, and LAM was obtained. The LAM was used as coating antigen to detect LAM-IgG by indirect ELISA.

Results

The relative molecular weight of the prepared LAM was determined by silver staining of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SOS-PAGE). The result was approximately 37 000, consistent with the reference material. The positive rate of LAM-IgG was 71.3% in 115 pulmonary tuberculosis patients. The false positive rates were 11.9% in 92 other non-tuberculosis lung disease patients and 3.2% in 189 healthy subjects. The sensitivity and the specificity were 71.3% and 93.9%.

Conclusions

LAM antigen is prepared successfully and can be used as coating antigen in indirect ELISA to detect anti-MTB antibody.

Keyword: Lipoarabinomannan; Mycobacterium tuberculosis; Antigen; Enzyme-linked immunosorbent assay

我国是结核病的高感染、高发病率国家,结核病的患者数在世界各国中居于第2位。寻找快速、准确、及时诊断结核病的新方法是控制结核病的重要手段。血清学检查因其取样方便、操作简便、快速、不依赖病原菌的检查,是临床上诊断结核病的重要辅助手段。但特异性免疫诊断依赖于特异性抗原。近十几年来人们关注到一类菌壁糖脂抗原—脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomanan, LAM)。LAM是细胞壁的主要成分,在结核分枝杆菌(MTB)与宿主的相互作用中起着关键作用并深刻影响细胞、体液免疫的发生与发展。但国内一直未见LAM提取纯化的相关报道,本研究参照国外有关文献[ 1],并略作改进,从MTB中提取了LAM,初步建立了LAM的提取纯化方法,并将其作为包被抗原检测结核患者血清抗体,取得了较为满意的结果。

材料和方法
一、材料

1.菌种 MTB标准菌株H37Rv为上海市肺科医院菌株库保存菌株。

2.培养基 改良罗氏培养基由上海市肺科医院检验科提供。

3.主要试剂和仪器 DNase I 酶、RNase酶为Sigma公司提供,氯仿、甲醇、苯酚、硫酸、乙醇均为国产分析纯。细胞粉碎机为宁波新芝超声设备有限公司产品。AKTA design系统、Sephacryl-100凝胶过滤层析柱为GE公司产品。

4.血清标本 全部来自上海市肺科医院2010年1月至6月住院患者和健康体检者,其中结核患者115例,男62例,女53例,年龄1172岁,平均(39±6)岁;非结核肺部疾病患者92例,男56例,女36例,年龄3373岁,平均(48±5)岁;健康体检者188名,男102名,女86名,年龄2034岁,平均(25±3)岁。

5. ELISA试剂 酶标板为科华生物公司96孔板,酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,为Sigma公司产品,底物为华美公司的四甲基联苯胺(TMB)。包被抗原的缓冲液为0.05 mol/L、pH值9.6碳酸盐缓冲液;封闭液为0.01 mol/L、pH值7.4磷酸盐缓冲液(PBS),内含3%脱脂奶粉;标本稀释液为0.01 mol/L、pH值7.4的PBS,洗涤液为0.05%Tween-20的PBS,终止液为1 mol/L的H2SO4。

二、方法

1.LAM抗原的提纯 将MTB H37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上,37 ℃培养34周,收取菌落,100 ℃ 2 h灭活细菌,用蒸馏水和PBS(pH值7.4)各洗涤1次,再用氯仿∶甲醇=2∶1混合液脱脂3次,去除菌体中的培养基成分。研磨菌体,用PBS(pH值7.4)悬浮,冰浴超声破碎(5 s,10 s,30 min),超声破碎后的溶液加入等体积的无水乙醇,在95 ℃水浴锅中回流1 h,离心取上清,对PBS(pH值7.4,1 mmol/L MgCl2)透析3 d,聚乙二醇20000(PEG20000)浓缩,沉淀抗酸染色镜检未见完整菌体。加入DNase I酶、RNase酶,37 ℃过夜。所得溶液加入等体积88%的苯酚溶液,70 ℃振荡60 min后,4 ℃ 4 300 r/min离心(离心半径20 m)30 min取水层,将酚层加入等体积水再抽提1次。合并水层。流水冲洗2 d,再对蒸馏水透析2 d。PEG20000浓缩为原来体积的1/4。选取Sephacryl S-100凝胶柱层析,连接AKTAdesign系统。用 NaCl(0.05 mmol/L)溶液洗脱,流速0.5 mL/min,2 mL/管收集,每管用苯酚—硫酸法跟踪检测糖含量。

2.LAM的鉴定 浓缩胶5%,分离胶15%,浓缩胶工作电压100 V,分离胶工作电压150 V。标本和LAM对照标准品(克罗拉多州立大学赠送的LAM抗原,浓度1 mg/mL)煮沸3 min,加样量20 μL。电泳后分别用考马斯亮蓝染色和硝酸银染色。考马斯亮蓝染色参照常规方法操作。硝酸银染色[ 2]用高碘酸、乙醇、乙酸混合液氧化过夜,硝酸银氨水溶液避光浸泡10 min,水洗,加入甲醛、柠檬酸还原液开始显色。标本糖含量测定:苯酚—硫酸法测定标本中多糖的含量,取浓硫酸1 mL,9%苯酚200 μL,标本200 μL,以无水蔗糖为多糖标准, 制作浓度范围0.2 ~3.0 mg/mL的标准曲线,测吸光度( A)485值,直线回归计算标本中多糖含量;标本和标准品蛋白含量的测定:Bradford法测定标本和标准品中蛋白的含量,取标本和标准品各20 μL,加入考马斯亮蓝G250试剂200 μL,以牛血清白蛋白作蛋白标准,制作浓度范围0 ~10 μg/mL的标准曲线,测其 A600值,直线回归计算标本和标准品中蛋白含量。

3.酶联免疫吸附试验(ELISA) 用包被缓冲液将LAM抗原做系列稀释,分别以0.5、1、2、5和10 μg/mL的浓度包被酶标板,经棋盘方阵滴定法选择包被抗原的工作浓度,然后将LAM稀释至最适包被浓度,酶标板每孔加入100 μL,置4 ℃过夜。洗涤3次,在吸水纸上拍干以后每孔加封闭液300 μL,置37 ℃ 2 h,洗涤3次,每孔加入标本稀释液稀释的血清标本100 μL,置37 ℃ 1 h,洗涤3次拍干。每孔加入100 μL工作浓度的酶标抗体(羊抗人IgG-HRP),置37 ℃ 1 h,洗涤3次拍干。每孔加入100 μL TMB底物溶液,置37 ℃ 10 min。最后每孔加入50 μL的终止液,在酶标仪上测定每孔的 A450值。

三、统计学方法

应用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)对数据进行统计学分析。数据符合正态分布,采用 t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、LAM提纯结果

AKTAdesign系统自动收集144管收集液,从A1到L12。苯酚硫酸法检测每管收集液的多糖浓度得出一个糖峰:B6-C2,见 图1,可确定B6-C2对应的收集液中含有LAM糖。将此收集液合并浓缩到5 mL,得到标本。

图1 苯酚-硫酸法跟踪糖浓度

二、LAM鉴定结果

标本经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),考马斯亮蓝染色未见明显条带,可见蛋白含量很低。硝酸银染色得到一个与标准品大小一致的亮黄色条带,与蛋白Marker染出的黑色条带区别明显,大小约37 000,见 图2。苯酚硫酸法测LAM标本中LAM糖含量为1.2 mg/mL,Bradford法测LAM标本中蛋白含量为18 μg/mL(标准品中蛋白的含量为15 μg/mL),可见标本中LAM糖为主要组分。

图2 SDS-PAGE电泳图

三、ELISA检测LAM-IgG的最佳条件

经棋盘方阵滴定法确定的ELISA检测LAM-IgG最佳条件为 LAM抗原1∶1 000稀释1 μg/mL包被,血清标本1∶400稀释,酶标抗体为1∶20 000稀释,显色时间10 min。

四、血清标本ELISA检测结果

115例结核患者、188名健康体检者、92例非结核肺部疾病患者血清LAM抗体结果,见 表1及 图3。比较发现,LAM抗体在结核组明显高于疾病对照组和健康体检组,差异均具有统计学意义( P<0.000 1)。以≥健康体检组的 A450均值+2 s(0.412 8)为阳性判读标准,结核组的阳性检出率为71.3%(82/115);疾病对照组和健康体检组假阳性率分别为11.9%(11/92)、3.2%(6/188)。总敏感性为61.5%,特异性为93.9%。

表1 3组研究对象血清LA从抗体检测结果

图3 检测LAM抗体ELISA结果散点图

讨论

LAM 是结核感染过程中重要的免疫反应调节因子,是MTB与巨噬细胞和树突状细胞作用的重要配体[ 3]。MTB能在巨噬细胞中存活,很大程度上是依赖于LAM对吞噬溶酶体合成的抑制[ 4]。其次,LAM能抑制γ干扰素(IFN-γ)的转录和削弱巨噬细胞的吞噬杀伤作用[ 5]。因此,LAM作为MTB的重要抗原,一直是结核病发病机制、免疫病理、诊断治疗的研究靶点。国外研究者对LAM-IgG检测用于结核病诊断做过研究[ 6],并开发出相应的诊断试剂盒。国内也有学者购买国外的抗原或试剂盒开展应用评估[ 7, 8],但未见自主提纯制备LAM抗原并用于结核病血清学诊断的报道。

依赖进口试剂,价格较为昂贵,限制了此项诊断技术的应用推广,也限制了一系列以LAM为突破口的针对结核病的研究。本研究旨在摸索LAM抗原的国产化方向,并尽可能简化优化纯化方法,将纯化得到的LAM抗原初步运用于血清学诊断,也为以后以LAM为基础的研究提供充足的材料来源,如对LAM的功能研究、专一抗体制备、抗结核药物的筛选分析、MTB感染的诊断和检测以及预后应用都有很大的意义。

关于LAM的纯化,Hunter等[ 9]曾用离子交换层析和凝胶层析的方法,Leopold等[ 10]也曾用疏水作用色谱的方法,皆比较繁琐。本研究在Hamasur等[ 1]方法的基础上添加了将菌体脱脂和超声后的乙醇回流2个步骤,脱脂能除去培养基的污染,为LAM的纯度奠定基础;乙醇回流能使菌体破碎的更完全,提高提取的效率。回流得到的上清,经DNase I酶、RNase酶除去DNA和RNA, 热酚水法去蛋白,氯仿∶甲醇去酚和脂质,得到粗的脂多糖。再将脂多糖经过Sephacryl-100凝胶过滤层析分离纯化,用苯酚硫酸法跟踪洗脱液的糖浓度,得到一个糖峰,将此糖峰对应的收集液合并浓缩得到标本,总过程用时1周。标本经SDS-PAGE银染确定为LAM,含量为1.2 mg/mL,比对照标准品1 mg/mL高;蛋白含量18 μg/mL,也比对照15 μg/mL略高,浓度和纯度都比较理想。

用此LAM抗原,通过ELISA检测了115例结核病患者、92例非结核肺病患者及188名健康体检者血清的LAM抗体,敏感性为71.3%,特异性为93.9%。值得一提的是,在非结核肺病患者组,11例假阳性中,有5例上海奥普生物公司生产的TB-Dot试剂盒检测结果也为阳性。TB-Dot试剂盒为国内临床大范围使用的结核抗体试剂盒,可靠性比较高,故不能排除这5例有合并结核的可能。Sade等[ 6]检测了31例肺结核患者和117例其他疾病患者及健康对照者血清,敏感性80.6%,特异性91.5%。马玙等[ 8]用ELISA检测90 例肺结核患者血清、53例肺癌患者及30名正常人血清,敏感性82.0%,特异性94.0%,敏感性的差异可能和ELISA的一系列条件有关,如抗原纯度、抗原包被浓度、血清稀释度、酶标抗体效价、显色系统等诸多因素。

有报道检测脑脊液中抗LAM抗体对结核性脑膜炎[ 11]和检测胸水中抗LAM抗体对结核性胸膜炎[ 12]的诊断价值都较高。而且有国外学者探寻用ELISA在尿液中[ 13] 、痰液中[ 14]、脑脊液中[ 15]检测LAM抗原诊断结核病。因此,有关抗LAM抗体和LAM抗原检测的相关研究,我们正在进一步探索之中。

The authors have declared that no competing interests exist.

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