1. CDK2的结构 CDK2由298个氨基酸组成,典型的CDK2有N末端和C末端。其N末端为182位氨基酸残基,其中大部分为β折叠;C末端为83297位氨基酸残基,大部分为α折叠,包含有与CDK2活化有关的关键性片段残基T160。

2. CDK2的功能 CDK2是调控细胞周期重要的因子之一,可在G1/S转变期和S期通过与不同的物质结合发挥作用,决定着G1/S的转变以及S期的进程。此外,Neganova等^{[ 1]}发现CDK2在维持人胚胎细胞的多态性表现中也可能具有重要作用。

CDK的活性调节是细胞周期调控的核心,CDK与相应的细胞周期素(cyclin)结合是调控细胞周期进程的必要条件。

在G1早期,CDK4-cyclinD1和CDK6-cyclinD3复合物初步磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(pRb),pRb促使细胞释放少量转录因子E2F,E2F进入细胞核内激活cyclinE和cyclinA的转录,为细胞周期的顺利完成做准备。CDK2在细胞周期整个过程中持续表达。正常情况下除G1后期和S期外,CDK2在细胞核和细胞质中等量分布。此时CDK2处于单体状态,端粒环(T-loop)正对N端,从而封闭T160位点使其不能被激活,这时被称为“关闭”构象。CDK2在G1后期大量进入细胞核后^{[ 2]}可直接与cyclinE亚基结合,不仅使T-loop附近的一个脯丝苏丙异亮精苯丙螺旋重排,还将T-loop 移向C端,从而暴露出T160位点以及14位的苏氨酸和15位的酪氨酸(Threonine14/Tyrosine15, T14/Y15)。在G1/S期转变过程中有一个细胞的自我监测以保证遗传信息的稳定性和完整性,这就注定细胞在此阶段有一个短暂停滞,Wee1、髓鞘转录因子1(myelin transcription factor 1,Myt1)激酶和细胞分裂周期蛋白25(cell division cyclin 25,CDC25)^{[ 3]}是此时的主要调节因子。Wee1/Myt1磷酸化CDK2的T14/Y15两个位点,使CDK2-cyclinE不能被CDK活化酶(CDK active kinase,CAK)激活。细胞自我检测完成后CDC25对T14/Y15去磷酸化,使CDK2-cyclinE恢复至可激活状态。CAK对CDK2的作用位点主要是T160。T160被CAK磷酸化可使T-loop继续移向C端并发生构象改变,CDK2-cyclinE进入活化其底物蛋白阶段。CDK2-cyclinE推动细胞进入S期后即被蛋白酶水解,解离出来的CDK2将与cyclinA结合并作用于其下游底物以促进S期的顺利完成。

当DNA受损或出现错误时,细胞会通过毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白及其相关蛋白协同作用激活下游细胞周期检测点激酶1和2,下调CDC25去磷酸酶的活性,从而减慢CDK2-cyclinE的活化,阻滞细胞周期进程,为DNA的修复赢得时间。另外,细胞内还含有多种针对CDK-cyclin活性的小分子抑制因子,如CDK4抑制因子(inhibitor of CDK4,INK4)家族和CDK相互作用蛋白(CDK-interacting protein,CIP)/激酶抑制蛋白(kinase inhibited protein,KIP)家族等,能够抑制CDK-cyclin活性影响其对底物的磷酸化,从而导致细胞周期的停滞甚至细胞凋亡。

另外,在体外实验中发现CDK7/cyclinH/Mat1复合物能够磷酸化CDK2的T160位点,在体内试验中CDK7是调控CDK2活化的因子之一^{[ 4]},并且抑制CDK7的活性能够明显导致细胞周期的停滞,但是CDK7所组成的复合物是否就是CAK还是有单独的CAK物质的存在则无明确定论。Lolli等^{[ 5]}在研究中发现CDK7能够磷酸化CDK1、2、4、6,而只有CDK1、2能够磷酸化CDK7,并且CDK7、1、2都不能够自我磷酸化。但同年Abbas等^{[ 5]}却发表相反结论称CDK2能够自我磷酸化。对于CDK2在细胞周期中的自我磷酸化是否具有普遍性还是具有一定的特异性至今仍有一定争议,有待进一步的研究。

cyclin是调控CDK活性的主要因子,含有一段相对保守的区域-cyclin盒。其主要功能是与CDK结合并激活其活性,增强CDK与其特定底物的作用。与CDK2相关的cyclin主要有cyclinE和cyclinA 2种。

1. cyclinE cyclinE的表达随细胞周期呈明显波动,如成纤维细胞G1中期,其mRNA及蛋白表达明显升高,G1晚期或S早期达高峰,然后迅速下降。这种量的波动与其功能相符。cyclinE主要在G1晚期发挥作用,与CDK2形成的CDK2-cyclinE复合物是细胞从G1期进入S期的关键激酶。通过促进DNA复制起始复合物的组装、着丝粒复制以及S期组蛋白基因转录,减少细胞对生长因子的需要量,缩短G1期以促进G1/S时相转换。细胞周期进入S期后,CDK2-cyclinE则通过S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2, Skp2)和SCF形成的Skp2-SCF介导泛素化,被蛋白酶体降解,cyclinE的量开始下降。若CDK2-cyclinE降解受限或cyclinE表达量增高则引起中心体过增殖,扰乱有丝分裂,形成不稳定的染色体,从而诱发肿瘤。Karsunky等^{[ 6]}的研究发现,cyclinE与大鼠肉瘤蛋白一同引起转基因鼠T淋巴细胞过度增殖及恶性转化,说明cyclinE具有原癌基因的特性^{[ 6]}。

2. cyclinA cyclinA属S期和M期的周期蛋白,是细胞周期S期和G2/M期限制点正性调节因子。cyclinA基因家族包括cyclinA1和cyclinA2。cyclinA2在G0晚期出现,可分别与CDK2和CDK1结合从而调控G0期的进程和G0/G1转变,并且在S期cyclinA2能促进DNA合成,有利于细胞通过G2/M期转折点。在许多组织中,cyclinA1和cyclinA2基因表达并不同步,说明两者的功能不能相互替代。目前还未能将cyclinA确定为原癌基因。但有研究^{[ 7]}显示,肿瘤组织中的cyclinA表达显著高于非肿瘤组织。

目前已发现的CDK2底物有多种,并且不断发现新的底物蛋白如头框(forkhead box,FOX)家族蛋白、锚蛋白重复单位结构域17(ankyrin repeat domain 17,ANKRD17)等。

1. CDK2与FOX FOX蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子,不仅通过招募共激活因子调节基因转录,还能直接同凝聚染色质结合参与其重构,协同其他转录因子参与转录调节。在FOX蛋白家族中,研究较为深入的是FOXO亚族。在大多数情况下FOXO蛋白具有诱导细胞凋亡的作用。Huang等^{[ 8]}发现不论在体内还是体外CDK2都能够磷酸化FOXO1的Ser249位点,使FOXO1主要存在于细胞质内,无法入核与核内物质接触。当CDK2表达量或活性受到抑制,非磷酸化状态的FOXO1则进入细胞核,通过以下2种机制上调细胞死亡基因:一是与凋亡诱导因子编码基因的启动子区结合,促其表达从而传导凋亡信号;二是调整B细胞淋巴瘤-2家族中促凋亡和促存活因子之间的比例来间接诱导凋亡效应。在哺乳动物的增殖细胞(如纤维母细胞)中,FOXO亚族的主要作用不是促进凋亡而是抑制增殖,如在NIH 3T3细胞中,FOXO3a能与cyclinG的启动子区结合,诱导其表达以维持细胞处于静止状态,FOXO还能诱导p27表达,抑制CDK2等蛋白活性,从而阻止细胞从G1期向S期转变,抑制细胞增殖。

2. CDK2与ANKRD17 Deng等^{[ 9]}通过TAP-tag纯化技术分离鉴定发现1种新的CDK2底物蛋白——ANKRD17。ANKRD17蛋白有2个亚型,其N末端共有25种重组锚蛋白,中部有2种信号位点(出核信号位点和核定位信号位点),C末端为一个RXL单元。ANKRD17在多种组织中都有不同程度的表达,并且ANKRD17能够促进细胞周期S期的进程。通过基因沉默方法降低ANKRD17的表达后发现DNA的复制受到抑制,细胞中期出现停滞现象,同时CDK2的抑制因子如p53和p21等的表达量升高。进一步研究发现CDK2能够对ANKRD17上的3个位点(Ser1791、Ser1794 和Ser2150)磷酸化从而调节其活性,使其能够与MCM家族成员、细胞分裂周期蛋白6和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antige, PCNA)等DNA复制相关因子结合,调节细胞的增殖。以上发现表明ANKRD17可能是一个直接参与DNA复制进程的因子,并且可能与CDK2存在着某种正性调节关系。

CDK蛋白中有1个高度保守的ATP结合位点,该位点可与周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)结合。根据CKI蛋白的结构特征和他们在细胞周期中作用的不同靶位点被分为2类,第1类是INK4家族,包括p16^INK4a、p15^INK4b、p18^INK4c和 p19^INK4d,分别选择性抑制CDK4和CDK6;第2类是Cip/Kip家族,包括p21^Cip1、p27^Kip1和p57^Kip2,主要和CDK2及其复合物的活性调节有关。所有的Cip/Kip蛋白C末端均含有核定位序列,能被转运到细胞核内,通过其N端高度同源区域的60个氨基酸与CDK2-cyclin复合物结合并抑制其活性。p21^Cip1和p27^Kip1、p57^Kip2的作用底物有所不同,p21^Cip1C端的结构区能结合并抑制PCNA的活性,进而影响其激活DNA复制的能力。而p27^Kip1、p57^Kip2在C末端都含有1个QT控制区,另外p57^Kip2还有1个富含脯氨酸的区域和1个酸性区域。这2个区域被认为能够调控蛋白之间的相互作用。另外,值得一提的是p27^Kip1的直接作用底物和其他2个有所不同,其不仅能够与CDK结合,还能与cyclin结合。如在对CDK2-cyclin的作用中,p27^Kip1的CDK2抑制区域在和cyclin保守序列C-box结合的同时结合CDK2并改变CDK2的N末端结构,使CAK不能对其磷酸化。

Cip/Kip蛋白对细胞周期的调控有推动性,也有阻碍性。Cip/Kip蛋白可抑制单体cyclinD、E和A的活性,此外Cip/Kip蛋白对CDK-cyclin复合物的形成和功能上有一定的积极作用。在细胞周期中,CDK-cyclin复合物活化状态下有p21^Cip1的表达,低剂量的p21^Cip1对细胞周期CDK-cyclin复合物的形成和活化具有一定的协助作用;高浓度时,p21^Cip1与CDK2-cyclinE、PCNA形成四聚体能够明显导致细胞周期停滞^{[ 10]}。

肿瘤细胞以难以抑制的恶性增殖为主要特征。随着对肿瘤细胞周期及其调控机制的深入研究,逐渐认识到肿瘤是多基因变化导致的细胞周期紊乱,通过缩短或消除细胞周期的G1和G2期而实现快速失控性生长所致的一类疾病。肿瘤的过度增殖与癌细胞周期调控因子紊乱密切相关。CDK2被发现与多种疾病有关,如天疱疮^{[ 11]}、肿瘤等,其中以对肿瘤的相关性研究为主。国、内外有大量文献报道CDK2在肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等肿瘤中高度表达,并发现CDK2的异常表达可能是癌变过程中的早期事件,并在癌症的形成、发展过程中都起重要的作用。如Mihara等^{[ 12]}认为从口腔黏膜上皮异常增生到鳞癌CDK2的表达有显著改变,且CDK2的表达与淋巴结转移、肿瘤病理分级、侵袭方式及较短的存活期都有显著相关性。鉴于CDK2与肿瘤细胞发生、发展的相关性和重要性,调节CDK2的活性从而抑制细胞周期将为肿瘤治疗打开全新的局面。目前,试图找到更加具有特异性、作用点更明确、选择性更高、对患者的不良反应也更小的药物来抑制CDK2及其相关蛋白的活性,从而阻止肿瘤细胞的增殖以达到控制甚至根治肿瘤的目的已成为人们治疗肿瘤的新方向^{[ 1315]}。此外,国内、外在对CDK2与相关疾病的研究中均发现,CDK2不仅在肿瘤等疾病中高表达,还与疾病的发展有一定关系。所以CDK2不但能够作为肿瘤等类似疾病治疗的新靶点,还有望成为普查肿瘤等类似疾病新的化学标志物。

综合多项研究不难发现CDK2在细胞周期中具有不容忽视的重要性,但在小鼠基因方面的研究中却对此观点提出了质疑,如缺失CDK2、CDK4、CDK6的鼠胚胎细胞能够正常生长,但生长体积受限^{[ 16]}。在小鼠的肝实质细胞增生中CDK2也并非必须因子^{[ 17]},CDK2缺失的肝细胞增生中并未表现出明显异常。CDK2对细胞周期的作用是否具有种属特异性或是细胞特异性还有待于进一步研究。另外,在对CDK1的研究中发现,CDK1同样能够促进G1/S期的转变,表明CDK2在细胞周期中的作用具有可替代性。因此,能否通过抑制CDK2的活性来治疗疾病还有待证实^{[ 18]}。不过,在对CDK2的不断深入研究中,新的底物蛋白、调控因子和抑制因子等必将被我们一一了解,从而深化对细胞周期调控机制的认识,相信对人类从基因水平上认识肿瘤等难治性疾病方面做出不可估量的贡献。