引用本文
李道静, 何晓东, 李明, 孙利, 许维东, 沈佐君. 柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其六种代谢产物. 2011, 26(10): 667-671
LI Daojing, HE Xiaodong, LI Ming, SUN Li, XU Weidong, SHEN Zuojun. Simultaneous determination of methotrexate and its six metabolites in cells by on-line sample stacking capillary electrophoresis. Labratory Medicine, 2011, 26(10): 667-671  
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柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其六种代谢产物
李道静, 何晓东, 李明, 孙利, 许维东, 沈佐君
安徽医科大学附属省立医院 安徽省临床检验中心,安徽 合肥 230001

通讯作者:沈佐君,联系电话:0551-2283840-801

作者简介:李道静,女,1981年生,学士,主要从事临床生物化学研究

基金:国家自然科学基金资助项目(30672011); 安徽省自然科学基金资助项目(050430902); 安徽省人才开发资金资助项目(2005Z040);
摘要
目的

建立柱上堆积高效毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤(MTX)及其6种代谢产物氨甲蝶呤多聚谷氨酸链( MTXPG )的方法。

方法

采用高效毛细管电泳技术,以75 mmol/L磷酸盐缓冲液( pH值7.40 )作为分离介质,用水和乙腈( V/V=1∶1 )作溶剂重组残留样本的方法进行柱上样本堆积,0.5 psi压力进样,进样时间50 s,在分离电压28 kV、检测波长300 nm条件下对MTX和MTXPG进行分离。在此基础上,检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG的含量。

结果

通过不断改变分离缓冲液中异丙醇(5%、8%、10%,V/V)和羟丙基-β-环糊精( hp-β-CD )浓度(20、25、30 mmol/L),发现在含8%异丙醇、25 mmol/L hp-β-CD的缓冲液条件下,30 min内实现7种组分的完全分离。用水和乙腈( V/V=1∶1 )作溶剂重组残留样本进行柱上样本堆积的方法可使检测灵敏度提高10倍。

结论

建立柱上样本堆积高效毛细管电泳法可同时检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG。该方法具有高效、快速、简便、高灵敏度的特点。

关键词: 氨甲蝶呤; 氨甲蝶呤多聚谷氨酸链; 毛细管电泳法; 柱上样本堆积
中图分类号:R979.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)10-0667-05
Simultaneous determination of methotrexate and its six metabolites in cells by on-line sample stacking capillary electrophoresis
LI Daojing, HE Xiaodong, LI Ming, SUN Li, XU Weidong, SHEN Zuojun
The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Provincial Center for Clinical Laboratories, Anhui Hefei 230001, China
Abstract
Objective

To establish a method for simultaneous determination of methotrexate(MTX) and its 6 metabolites methotrexate polyglutamate (MTXPG) in cells by on-line sample stacking capillary electrophoresis.

Methods

The eletrophoresis buffer was 75 mmol/L Na2HPO4 (pH=7.40). The voltage of 28 kV was applied and the injection time was 50 seconds at 0.5 psi. The separation of MTX and MTXPG was performed at a wavelength of 300 nm, and sample stacking was achieved by using distilled water and acetonitrile (V/V=1∶1) as dissolvent. Under optimal condition, intracellular MTX and MTXPG levels were detected by capillary electrophoresis.

Results

The optimal condition was made by adjusting isopropanol concentration(5%, 8%, 10%, V/V) and hp-β-CD concentration (20, 25, 30 mmol/L). Seven substances were completely separated by capillary electrophoresis in 30 min. A 10 fold improvement in the amount of distilled water and acetonitrile (V/V=1∶1) could be achieved by on-line sample stacking method.

Conclusions

MTX and MTXPG in cells can be simultaneously separated by high-performance capillary electrophoresis efficiently, rapidly, conveniently and super-sensitively.

Keyword: Methotrexate; Methotrexate polyglutamate; Capillary electrophoresis; On-line sample stacking

氨甲蝶呤(MTX)作为叶酸代谢途径中抗肿瘤药物的“基石”,主要应用于治疗急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、头颈部癌、膀胱癌和肺癌等。小剂量应用可治疗一些非癌性疾病如银屑病、类风湿性关节炎等。MTX为叶酸类似物,主要借助于还原性叶酸载体(reduced folate carrier, RFC)进入细胞,进入细胞的MTX在胞浆和线粒体内2种亚型的叶酰聚谷氨酸合成酶(folypolyglutamate synthetase,FPGS)的作用下形成MTX多聚谷氨酸链(methotrexate polyglutamine,MTXPG),即链接上2~7个长度不等的谷氨酰链(MTX-Glu n,n=27 ),见 图1。

图1 MTXPG的形成

MTXPG为MTX在细胞内的活性代谢产物,其聚集量和链的长度决定着MTX细胞毒性和治疗效果[ 1]。MTXPG,尤其是大于3个链的存在于细胞内的时间比MTX长。因为其相对分子质量较大,不容易从细胞内溢出,所以能产生更强的细胞毒作用。同时,许多机理表明MTXPG链越长,长链所占比例越多,MTX对肿瘤细胞的杀伤作用越好。MTXPG的检测有利于评估治疗效果、指导药物用量、减少药物不良反应[ 2]。目前临床上关于MTX常规检测大部分是MTX血药浓度监测,对细胞内MTX及其代谢产物的检测报道较少[ 3]。细胞内MTXPG的检测通常采用高效液相色谱法进行分析。国、内外关于毛细管电泳法检测细胞内MTXPG的报道甚少。我们通过柱上样本堆积技术,成功地对MTX及其6种代谢产物MTXPG进行完全分离。

材料和方法
一、试剂与仪器

MTX、MTX-(Glu)2、MTX-(Glu)3、MTX-(Glu)4、MTX-(Glu)5、MTX-(Glu)6、MTX-(Glu)7(瑞士Sckircks Laboratory公司),羟丙基-β-环糊精(hp-β-CD)(美国Sigma公司),BECKMAN P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪,毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件公司),256 nm PDA检测器、32 Karats of software V7.0软件(美国Beckman-Coulter公司)。

二、分离缓冲液[75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.40,含25 mmol/L hp-β-CD )]的制备

准确称取磷酸氢二钠2.686 1 g,hp-β-CD 4.49 g,溶于100 mL双蒸水中,用磷酸调节pH值至7.40,4 ℃保存。每次使用时,取4.6 mL缓冲液,加0.4 mL异丙醇,反复颠倒混匀。

三、标准品的分离

将MTX、MTX-(Glu)2、MTX-(Glu)3、MTX-(Glu)4、MTX-(Glu)5、MTX-(Glu)6、MTX-(Glu)7 标准品母液用水和乙腈(V/V=1∶1)稀释至5 μmol/L。毛细管长度60 cm、毛细管直径75 μm、毛细管温度25 ℃、PDA检测器λ= 300 nm条件下进行检测。新的毛细管使用前分别用1 mol/L HCl溶液、去离子超纯水、1 mol/L NaOH溶液、去离子超纯水、电泳缓冲液活化20 min。每次使用前依次用1 mol/L NaOH溶液冲洗 3 min、0.1 mol/L NaOH溶液冲洗3 min、电泳缓冲液冲洗3 min、去离子超纯水0.1 psi压力进样2 s、样本 0.5 psi压力进样50 s,分离电压28 kV,30 min内可实现各组分的完全分离。

四、柱上堆积技术提高检测灵敏度

将标准品母液分别用0.01 mol/L NaOH溶液、水和乙腈(V/V,1∶1)稀释,各组分终浓度为5 μmol/L,然后上机检测。0.5 psi压力分别进样5、50 s。观察两者峰性、峰面积以及柱效的变化。

五、实际样本的处理

以非小细胞肺癌A549细胞株为研究对象,用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基,在5% CO2、37 ℃条件下进行孵育培养。将处于对数生长期的细胞加入MTX,孵育24 h,台盼蓝染色,细胞计数108 个。立即收集细胞,4 ℃下1 000 r/min(离心半径12 cm)离心10 min,弃上清,用冰的PBS洗涤2 次,采用细胞匀浆器破坏细胞,显微镜下观察,直到细胞完全破坏为止。14 000 r/min(离心半径6 cm)离心15 min,细胞裂解液定容至500 μL,加100 μL 20%高氯酸,充分振荡混匀10 s,14 000 r/min(离心半径6 cm)离心15 min去除蛋白,上清液加20 μL饱和的氢氧化钠,将样本通过3 mL Sep-pakC18柱[配制 6 mL溶液A(98%水、2%乙腈、0.1%甲酸)和4 mL溶液B(20%水、80%乙腈、0.1%甲酸)],依次用2 mL溶液B活化、4 mL溶液A冲洗、上样、2 mL溶液A冲洗、2 mL溶液B洗脱,样本在56 ℃下用氮气吹干,溶于50 μL水和乙腈(V/V=1∶1)中,上机检测。

结果
一、分离条件的优化

通过不断优化分离缓冲液中hp-β-CD浓度(20、25、30 mmol/L)、磷酸氢二钠浓度(50、75、100 mmol/L)、异丙醇浓度(5%、8%、10%)、pH值(7.20、7.40、7.60)和分离电压(20、25、28 kV),发现分离MTX及其代谢产物的最佳电泳条件为:在75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.40,含25 mmol/L hp-β-CD、8%异丙醇),0.5 psi压力分别进样50 s,分离电压28 kV,检测波长300 nm条件下进行样本分离。标准物质图谱见 图2。

图2 7种标准物质电泳图谱

二、精密度、回收率实验

将50 μL 5 μmol/L MTX、MTX-(Glu)2、MTX-(Glu)3、MTX-(Glu)4、MTX-(Glu)5、MTX-(Glu)6、MTX-(Glu)7 7种标准品溶解于500 μL细胞裂解液中,与样本处理方式相同[加100 μL 20%高氯酸,充分振荡混匀10 s,14 000 r/min(离心半径6 cm)离心15 min去除蛋白,上清液加20 μL饱和的氢氧化钠,将样本通过3 mL Sep-pakC18柱,样本在56 ℃下氮气吹干,溶于50 μL水和乙腈(V/V=1∶1)中],然后上机检测。与过柱子前的50 μL 5 μmol/L标准品比较,发现各组分的样本回收率均在90%以上。连续5 d处理同一样本,分析其样本前处理批间变异系数( CV),见 表1。

表1 MTX及其代谢产物的样本回收率和重复性
三、柱上样本堆积结果

用水和乙腈(V/V=1∶1) 溶解的5 μmol/L标准品0.5 psi压力分别进样50 s,与进样时间5 s相比,可获得柱前10倍的浓缩效果而保持较好的柱效。结果见 图3。说明该方法可用于柱上样本富集,提高检测灵敏度。

图3 柱上样本堆积结果

四、最低检出限

通过不断减少各种标准物质浓度,以信噪比(S/N)=2为标准,确定的最低检测灵敏度MTX、MTX-(Glu)2、 MTX-(Glu)3为0.2 μmol/L,MTX-(Glu)4、MTX-(Glu)5、MTX-(Glu)6、MTX-(Glu)7 为0.5 μmol/L。

五、回归方程

用水和乙腈(V/V=1∶1)不断稀释改变MTX及MTXPG标准品的浓度,混合物重复配制3次,毛细管电泳法检测5次,求峰面积的平均值。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线见 表2。结果显示MTX及MTXPG浓度-峰面积具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上。

表2 MTX及其6种代谢产物的回归方程
六、实际样本的分离

为了验证本方法在检测细胞内MTX及其代谢产物的含量方面应用的可行性,将处于对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞加入50 μmol/L MTX,孵育24 h,细胞计数108个。按照上述样本处理方法,上机检测。通过加入标准品进行样本峰的确认。电泳图谱见 图4。

图4 实际样本的分离

讨论

MTXPG存在细胞内,含量非常低,且其各组分浓度相差较大,各分子式间相差1~6个谷氨酸残基,同时分离和检测细胞内MTXPG各组分的难度非常大。目前关于MTXPG的检测方法有高效液相色谱法和毛细管电泳法。高效液相色谱法检测MTXPG常用的定量方法[ 4, 5]有:(1)放射性核素标记3H MTX法,该方法灵敏度较高,能够定量MTXPG每一个组分,但耗时较长,设备要求较高;(2)通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR),根据还原型辅酶Ⅱ(NADPH)量的变化进行定量,但缺乏特异性;(3)荧光法,该方法特异性高、敏感性强,但不能分离和定量长链MTXPG。毛细管电泳法检测MTXPG方法的出现,使得操作简便、省时省钱、无需特殊设备直接进行检测。但毛细管电泳法也有其自身不足之处,如由于进样体积较少,灵敏度不高[ 6, 7]。本研究采用柱上样本堆积技术使检测灵敏度提高1个数量级,为毛细管电泳法分析微量超微量样本提供新的思路[ 8]。通过不断优化分离条件,对MTX及其6种代谢产物进行完全分离,并结合固相萃取技术成功地对细胞内MTX及其代谢产物进行检测。本研究结果表明样本回收率>90%,回归方程相关系数>0.99,柱上样本堆积法可使灵敏度提高10倍,最低检出线>0.5 μmol/L。说明该方法重复性好、灵敏度高、快速(30 min内完成样本分离)、方便(不需大量配制缓冲液和特殊仪器)、经济,适合于临床样本检测。

由于MTXPG存在细胞内,细胞内含有大量的蛋白质,给毛细管电泳的检测带来极大的困难。本研究比较了几种蛋白质沉淀剂:因MTX不溶于甲醇和乙腈,故不能用甲醇和乙腈作为蛋白质沉淀剂;10%三氯乙酸容易使MTX链发生断裂;用高氯酸杂峰少,且使蛋白质沉淀更完全,同时为了防止高氯酸浓度过高破坏MTXPG,选择20%高氯酸。使用Sep-pakC18柱的目的:一方面使大量的样本体积浓缩到几十微升,提高检测灵敏度;另一方面可以去除蛋白和高盐对样本分离的影响。实验过程中,本研究发现样本在56 ℃下用氮气吹干的方法浓缩样本,对检测结果影响不大。

MTXPG的检测有利于评估治疗效果、指导药物用量、减少药物不良反应。MTX治疗患者的疗效很大程度上取决于个体对药物的不良反应差异、对药物的敏感性、细胞内MTXPG含量和链的长度。检测细胞内MTXPG有助于监控患者的治疗情况,准确地判断预后。如Stamp等[ 9]对低剂量MTX治疗的类风湿性关节炎患者进行MTXPG药物浓度和药物代谢动力学监测,对治疗效果进行预判。本研究实现了MTX及其代谢产物MTXPG的完全分离, 将为MTXPG研究提供新的研究方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

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