引用本文
庄俊华, 郑松柏, 王建兵, 黄宪章, 马艳, 徐宁, 周华友, 陈茶. 天门冬氨酸氨基转移酶“改良参考方法”的建立及其用于测定结果的可比性研究. 2011, 26(10): 662-666
ZHUANG Junhua, ZHENG Songbai, WANG Jianbing, HUANG Xianzhang, MA Yan, XU Ning, ZHOU Huayou, CHEN Cha. Research on the comparability of AST results by improved reference method. Labratory Medicine, 2011, 26(10): 662-666  
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天门冬氨酸氨基转移酶“改良参考方法”的建立及其用于测定结果的可比性研究
庄俊华, 郑松柏, 王建兵, 黄宪章, 马艳, 徐宁, 周华友, 陈茶
广东省中医院检验医学部,广东 广州 510120

作者简介:庄俊华,女,1951年生,研究员,主要从事临床生化与实验室质量管理研究。

基金:国家“十一五”计划科技重大专项(2008ZX09312-021); 广东省科技计划项目(2010B031600128); 广东省医学科研基金课题(A2010216);
摘要
目的

应用不含磷酸吡哆醛的参考方法评价不同实验室间天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定结果的可比性。

方法

参照国际检验医学溯源联合会(JCTLM)推荐的参考方法及日本临床化学会相关文件,建立不含磷酸吡哆醛的AST参考方法。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)系列文件对该方法的精密度、正确度、线性范围等性能进行评价。应用该参考方法对新鲜血清进行赋值作为校准品校准广州地区10家实验室的常规检测系统,比较校准前、后新鲜血清、能力验证样本以及市售制备物质测定结果间的偏倚,进行检验结果的可比性评价。

结果

改良参考方法的批内不精密度<1%,总不精密度<2%;检测日本临床化学会酶参考品结果均在其不确定度允许范围内,参加参考实验室网络赋值计划测定结果与均值比较在等效限内。改良AST参考方法分析测量范围上限为413.6 U/L。校准前新鲜血清测定结果与参考方法测定结果之间偏倚>20%的所有11个测定结果中,有10个测定结果来源于用理论K值计算酶活性的检测系统;校准前新鲜血清组最大偏倚为-25.0%,平均偏倚为 9.3%;使用改良参考方法定值的酶校准品校准后,最大偏倚降为12.3%,平均偏倚降为2.1%。而能力验证样本和市售制备物中AST测定结果的平均偏倚在校准前后则变化不大,市售制备物组平均偏倚反而略有升高。

结论

应用参考方法定值的新鲜血清作为校准品进行校准是实现不同检测系统检验结果一致性和可比性的有效途径,非新鲜血清样本存在不同程度的基质效应。

关键词: 天门冬氨酸氨基转移酶; 磷酸吡哆醛; 校准; 参考方法
中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)10-0662-05
Research on the comparability of AST results by improved reference method
ZHUANG Junhua, ZHENG Songbai, WANG Jianbing, HUANG Xianzhang, MA Yan, XU Ning, ZHOU Huayou, CHEN Cha
Department of Clinical Laboratory, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangdong Guangzhou 510120,China
Abstract
Objective

To research the comparability of aspartate aminotransferase(AST) results among different laboratories by a reference method without pyridoxal phosphate.

Methods

The improved reference method without pyridoxal phosphate for AST was established according to the documents of Jonit Committee for Traceability in Laboratory Medicine(JCTLM) and Clinical Chemistry Society of Japan. The precision, accuracy and linear range were evaluated according to the documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The improved reference method was used to evaluate the comparability and calibrate the bias of AST results among 10 different laboratories in Guangzhou. The evaluation was performed before and after a calibration by a common serum calibrator that had a value assigned by the reference method.

Results

For the measurement with improved reference method, the within-run coefficient of variation (CV) was less than 1%, and the totalCV was less than 2%.The biases with target values of JC-ERM and network evaluation results all fulfilled the requirements. The upper limit of the AST measurement range of improved reference method was 413.6U/L.Among the 11 testing systems, the bias of AST fresh serum before calibration compared with the reference method was >20%, and 10 were enzyme activity computed with theoretical K value. The maximum bias of AST results of fresh serum before calibration was -25.0%, and the average bias was 9.3%. Calibrated with enzyme calibrator of the improved reference method, the maximum bias decreased to 12.3%, and the average bias was 2.1%. The average bias of AST results of external quality assessment materials and commercial materials showed no significant difference before and after the calibration. Furthermore, the average bias of the commercial materials increased a little after the calibration.

Conclusions

The traceability of AST measurement can be effectively improved in different testing systems by using a common fresh serum calibrator that has a value assigned by the reference method. There are some matrix effects in non-fresh-serum calibrators.

Keyword: Aspartate aminotransferase; Pyridoxal phosphate; Calibration; Reference method

天门冬氨酸氨基转移酶(AST)是临床实验室血清酶学测定中非常重要的常规项目,其测定的准确性直接影响到肝脏疾病的诊断、疗效和预后判断。目前国内实验室大多采用非配套检测系统,即大多采用进口仪器和校准品,但试剂为国产试剂;或改变配套检测系统的检验程序,致使校准品丧失溯源性,导致不同检测系统或方法的检验结果存在较大差异,缺乏可比性[ 1]。尽管国内已有厂商实验室初步建立了由国际检验医学溯源联合会(JCTLM)公布的37 ℃条件下AST的参考方法。但是该方法配方含有磷酸吡哆醛,而几乎所有国产试剂均不含磷酸吡哆醛,由参考方法传递的准确性有差异。有鉴于此,我们参照JCTLM推荐的参考方法及日本临床化学会颁布的方法[ 2, 3],建立不含磷酸吡哆醛的AST参考方法(以下称改良参考方法),同时参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)系列文件和相关文献对建立的改良参考方法进行方法学性能评价,验证其是否具有比常规方法更小的不确定度并了解其各项性能指标。并且应用改良AST参考方法对制备的新鲜血清来源的酶校准品进行定值,了解用定值的酶校准品校准广州地区10家实验室检测系统后与参考方法间测定结果的偏倚,评价不同实验室间校准前、后AST测定结果的可比性。

材料和方法
一、材料

1. 参考方法所用仪器和试剂 (1)仪器:日本HITACHI U-3310紫外可见分光光度计(带半导体温控和磁力搅拌),美国FLUKE公司Hart点式温度计,德国EPPENDORF公司Research型移液器,美国JULABO ED-19型恒温水浴箱,德国SARTORIUS CP225D 十万分之一分析天平,德国SARTORIUS DOCU-酸度计,法国MILLIPORE Simplicity UA型超纯水机,各种高精度玻璃器皿;(2)试剂:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、L-天门冬氨酸、α-酮戊二酸二钠盐、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)、氯化钠(NaCl)、叠氮钠(NaN3)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、丙酮酸、草酰乙酸等来源于sigma公司,乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、牛血清白蛋白等来源于Roche公司。

2. 常规检测系统组成 (1)系统1:ROCHE Modular PPI全自动生化分析仪、罗氏试剂(批号:621021)、cfas校准品;(2)系统2:OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪、配套试剂(批号:6283)及校准品;(3)系统3:OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪,配套试剂(批号:6412)、cfas校准品;(4)系统4:HITACHI 7600全自动生化分析仪,深圳迈瑞试剂盒(批号:0110708006)、使用理论K值;(5)系统5:HITACHI 7170A全自动生化分析仪,中生北控试剂盒(批号:080191)、cfas校准品;(6)系统6:HITACHI 7600全自动生化分析仪,中生北控试剂盒(批号:08181)、使用理论K值;(7)系统7:OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪, Wako试剂盒(批号:AR106)、cfas校准品;(8)系统8:OLYMPUS AU5421全自动生化分析仪,中生北控试剂盒(批号:080191)、cfas校准品;(9)系统9:HITACHI 7170全自动生化分析仪,中生北控试剂盒、使用理论K值(批号:080191);(10)系统10:BAYER 1650全自动生化分析仪,四川迈克试剂盒(批号:0708181)及厂家校准品,此系统提供数据不完整,未纳入统计。

3. 样本 (1)患者新鲜血清:外观应澄清,无溶血、黄疸及脂血,保存于-20 ℃,浓度应覆盖医学决定水平,位于50400 U/L之间;(2)市售制备物:Roche公司正常值质控品(PNU,批号:17898501)、病理值质控品(PPU,批号:17453109)、cfas校准品(批号:17882001)、RANDOX质控品(批号:522UN);(3)能力验证盲样:广东省临检中心能力验证盲样(批号:200821、200822、200823)、国际参考实验室能力验证盲样(批号:2007A、2007B)、卫生部临床检验中心能力验证盲样(批号:200707、200708);(4)日本临床化学会酶参考品JC-ERM(批号:006);(5)制备酶校准品:收集新鲜人血清,混匀,用参考方法定值分装,保存于-20 ℃。质控品及校准品按要求溶解,并分装成10份,保存于-20 ℃。

二、方法

1. 参考方法的改良 1.17 g Tris和0.052g叠氮钠溶于80 mL去离子水中,用1 mol/L盐酸调节pH值至7.65(37 ℃),转移至100 mL容量瓶中,将容量瓶和水平衡至20℃,加水至容量瓶的校准刻度线(20 ℃),用此溶液替代AST试剂中的磷酸吡哆醛溶液。

2. 主要性能评价 (1)参照CLSI EP5-A2文件[ 4]测定PNU和PPU 2个水平的质控品,计算批内和室内不精密度,设定目标为批内不精密度<1%,室内不精密度<2%;(2)根据CLSI EP15-A文件[ 5]用改良参考方法检测以下物质,将结果与设定目标比较:①检测日本临床化学会酶参考品JC-ERM 3次,计算均值,比较其结果是否在给出的不确定度内;②参加北大医院组织的酶学参考实验室赋值计划,测定结果与均值比较,观察其相对偏倚是否在等效限内(±5.25%);(3)参考CLSI EP6-A文件[ 6],设定实验室的重复性和线性的允许误差范围分别为1%和5%,进行线性范围的评价。

3. 校准前、后比对实验 (1)各实验室首先对参加本次调查的生化分析仪进行日常维护保养,并保证当日室内质控在控。测定时,将样本从-20 ℃冰箱取出后室温下静置30 min,颠倒混匀5次,再静止5 min,按照本实验室标准操作程序测定样本。每份样本重复测定2次,记录测定结果,计算均值。在样本的重复测定中,指定第1次测定顺序,按反向顺序检测第2次(例如:样本可以按下述顺序进行:A、B、C、D、E、F、G、H和H、G、F、E、D、C、B、A)。第2次样本的反向顺序可以减少交叉污染及漂移对重复测定样本平均值的影响,于取出后3 h内完成测量;(2)收集浓度为70 U/L左右的新鲜血清使用改良的参考方法每天测定5次,共测定2 d,去除离群值后计算均值,以该均值作为校准值;(3)使用新鲜血清校准品校准各实验室的检测系统,校准后按照“(1)”中所述方法重新测定所有样本。

三、统计学方法

所有统计学处理均在Microsoft Excel 2003及SPSS 13.0上进行。

结果
一、改良参考方法的主要性能

改良参考方法测定PNU的批内变异系数( CV)与室内 CV分别为0.97%、1.48%,测定PPU的批内 CV与室内 CV分别为0.74%、1.14%,均<设定目标。使用该方法检测酶参考品结果在其不确定度允许范围内,参加参考实验室网络赋值计划测定结果与均值比较在等效限内,见 表1。AST线性评价结果显示最适方程为二次多项式回归模型,但其非线性偏倚可接受,因此AST改良参考方法分析测量范围的上限为413.6 U/L。

表1 改良AST参考方法的正确度评价
二、酶校准品定值

用改良参考方法测定制备的酶校准品的结果均值为74 U/L。此值作为校准常规检测系统的靶值。

三、各检测系统校准前、后AST测定结果与参考方法测定结果的偏倚分析

各检测系统校准前,新鲜血清组AST测定结果与参考方法测定结果之间偏倚>20%的所有11个测定结果中,有10个测定结果来源于系统6和系统9。各系统检测结果的平均偏倚结果见 表2。

表2 校准前后测定结果的偏倚比较(%)
四、各组别校准前、后偏倚的比较

各检测系统校准前检测新鲜血清组的AST的最大偏倚为-25.0%,平均偏倚为9.3%;使用改良参考方法定值的酶校准品校准后,最大偏倚降为12.3%,平均偏倚降为2.1%。能力验证盲样和市售制备物中AST测定结果的平均偏倚在校准前、后变化不大。市售制备物组平均偏倚反而略有升高,结果见 表3。

表3 各组别校准前、后偏倚比较(%)
五、各常规检测系统校准前、后测定新鲜血清结果的K值、 R2值及直线回归方程比较

K值有明显改变,变异范围从-2.05%~19.65%,结果见 表4。

表4 新鲜血清组校准前、后各系统K值、 R2值及直线回归方程比较
讨论

保证临床检验结果的准确性和可比性,是临床检验质量控制的核心问题。开展量值溯源工作则是提高和保证检验结果准确性和可比性的有效手段,而量值溯源的基础就是参考系统[ 7, 8]。2002年国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)发布的参考方法也从根本上提出了酶活力检测必须使用完整的检测系统、依靠校准品的定值,才能使酶检测结果实现全球的可比性。要实现酶检测结果的可比性,需要参考方法、参考实验室网络和参考物质来共同完成。

在溯源链中,各种级别的参考物质(包括各种校准物、质控物和有证标准物质)是量值的传递者,起到传递正确度的作用。但目前具有溯源性的酶校准品较少,而且价格昂贵。因此,国内仍有许多实验室在测定血清酶活性时不使用校准品,而是根据仪器系统特性,用理论K值计算酶活性。理论K值是酶活性浓度定量系数,主要用于酶活性的计算与校准,其受仪器光路、比色杯光径和质量、样本与试剂的比例、指示物的摩尔吸光系数以及试剂质量等因素影响。在临床工作中,厂家提供的试剂千差万别,不同批号的试剂其pH值、底物浓度等都有变化。本研究中检测系统6、9使用理论K值,结果显示各检测系统在用改良参考方法定值的酶校准品校准前,其新鲜血清测定结果与参考方法测定结果之间偏倚>20%的所有11个测定结果中,有10个测定结果来源于检测系统6、9。可见在现有条件的情况下,临床实验室应该停止使用理论K值,而应使用具有溯源性的校准品或根据试剂不同批号校准后的K值,以保证结果准确[ 9]。

目前,国内实验室大量使用的检测系统多为自建检测系统(即实验室根据自己意愿选择仪器、校准品、试剂等而建立的检测系统)。如何保证检测结果的可靠性和溯源性,是一个急需解决的问题。在本研究中,各自建检测系统校准前AST测定结果的溯源性及可比性很不理想,校准前新鲜血清组的最大偏倚为-25.0%,平均偏倚为9.3%;使用改良参考方法定值的酶校准品校准后,最大偏倚降为12.3%,平均偏倚降为2.1%。校准前符合偏倚要求[SE%<1/2美国临床实验室修正法规(CLIA '88)允许总误差,即<10%]的比例为64%,而校准后符合偏倚要求的比例为97.8%。以上结果均表明通过使用新鲜血清制备的酶校准品校准后,新鲜血清测定结果的准确性和一致性都得到了极大的提高。可见应用参考方法定值的新鲜血清作为校准品进行校准是实现不同检测系统间量值溯源的有效途径,从而保证了检验结果的准确性和不同检测系统间检测结果的可比性。本研究还发现,市售制备物以及能力验证样本在校准前、后变化不大,甚至校准后可比性更差,说明存在或多或少的基质效应影响,导致其表现于新鲜血清有差异。在使用这些处理过的样本时应注意其互通性对结果的影响。另外,为将校准后结果的准确、可比长期保持,后续实验应深入研究以下内容:如进行互通性和稳定性好的非血清材料的筛选、二级血清参考物质的研制、参考体系应用于常规实验室结果互认平台的建立等。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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