引用本文
汪雅萍, 应春妹, 张灏旻, 叶杨芹, 于嘉屏. 氟喹诺酮耐药志贺菌中质粒介导qnr基因的检测. 2011, 26(10): 645-647
WANG Yaping, YING Chunmei, ZHANG Haomin, YE Yangqin, YU Japing. The determination of plamid-mediated qnr gene in quinolone-resistantShigella . Labratory Medicine, 2011, 26(10): 645-647  
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氟喹诺酮耐药志贺菌中质粒介导qnr基因的检测
汪雅萍, 应春妹, 张灏旻, 叶杨芹, 于嘉屏
上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200127

作者简介：汪雅萍,女,1966年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物检验工作。

摘要
目的

检测志贺菌对氟喹诺酮抗菌药物的耐药情况,探讨氟喹诺酮耐药与志贺菌携带质粒介导qnr基因的关系。

方法

用纸片扩散法对100株志贺菌(福氏志贺菌50株,宋内志贺菌50株)进行耐药性检测,聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌质粒介导qnr基因并进行DNA测序,分析qnr基因的存在与药敏结果的关系。

结果

100株志贺菌中有9株检出qnr基因,检出率为9%(9/100),福氏志贺菌为4%(2/50),宋内志贺菌为14%(7/50);qnr基因阳性菌株对氧氟沙星的耐药率(11.1%)高于阴性菌株(5.5%),但差异无统计学意义。qnr基因阳性菌株对5种氟喹诺酮药物的抑菌圈中位数比较均缩小。

结论

宋内志贺菌质粒介导氟喹诺酮耐药qnr基因的携带率明显高于福氏志贺菌;志贺菌若携带质粒介导qnr基因则会导致对氟喹诺酮药物的敏感性下降。

关键词: 氟喹诺酮耐药; 志贺菌; 质粒介导qnr基因
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)10-0645-03
The determination of plamid-mediated qnr gene in quinolone-resistantShigella
WANG Yaping, YING Chunmei, ZHANG Haomin, YE Yangqin, YU Japing
Department of Clinical Laboratory,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China
Abstract
Objective

To investigate the quinolone-resistance ofShigella isolates and its relationship with the plamid-mediated qnr gene.

Methods

A total of 100Shigella isolates were collected.50 isolates wereShigella flexneri,and 50 isolates wereShigella sonnei. The drug resistance was determined by disc diffusion method. The qnr gene was detected by polymerase chain reaction(PCR). The qnr gene segments were amplified and sequenced to analyze the correlation between quinolone-resistance and the presence of qnr gene.

Results

The qnr gene was identified in 9 (9%)of the 100Shigella isolates,2(4%)of the 50Shigella flexneri and 7(14%) of the 50Shigella sonnei. The resistance rate of ofloxacin in qnr positive isolates(11.1%) was higher than that in qnr negative isolates(5.5%),but there was no statistical significance. The median diameters of 5 quinolone inhibition zones of the isolates with qnr gene were smaller than those without qnr gene.

Conclusions

The plamid-mediated qnr gene inShigella sonnei isolates is more than that inShigella flexneri isolates. The plamid-mediated qnr gene ofShigella isolates can decrease the resistance rate of quinolone.

Keyword: Quinolone resistance; Shigella; Plamid-mediated qnr gene

志贺菌( Shigella)是人类细菌性痢疾(菌痢)的病原菌,在过去的50年中,志贺菌通过获得耐药性质粒对磺胺类、四环素类及青霉素类等一线抗菌药物产生了耐药性[ 1],对复方磺胺甲口恶唑、氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦、头孢曲松等多种常用抗菌药物也耐药。从上世纪80年代开始, 随着氟喹诺酮药物在腹泻患者中的广泛使用,志贺菌对其耐药性已呈上升趋势。质粒介导的对萘啶酸耐药最早发现于1987年,但未得到证实。第1个氟喹诺酮耐药质粒于1998年在美国阿拉巴马州的一株临床分离的肺炎克雷伯菌中被发现[ 2],2003年日本的学者发现志贺菌中也存在qnr基因[ 3]。为了解仁济医院志贺菌的耐药情况,我们收集临床分离的100株志贺菌进行检测。

材料和方法
一、材料

1. 菌株 收集仁济医院2005年1月至2008年4月临床分离的志贺菌100株,其中福氏志贺菌50株,宋内志贺菌50株。标准菌株:宋内志贺菌(ATCC 25931): qnr基因阳性参考株:大肠埃希菌E12,由上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科惠赠。

2. 培养基与药敏纸片 血平板为上海伊华生物科技有限公司产品,水解酪蛋白(MH)平板为法国生物梅里埃公司产品。抗菌药物纸片氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、四环素、氯霉素、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、复方磺胺甲口恶唑、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢呋新为英国Oxoid公司产品。

3. 试剂 聚合酶链反应(PCR)引物[ 4]和相关试剂均购于闪晶生物科技有限公司。

4. 仪器 美国BD公司的Phoenix-100全自动微生物鉴定仪和美国PE公司ABI 7000荧光定量PCR分析仪,Tanon-2500凝胶成像系统。

二、方法

1. 细菌鉴定与分型 Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏系统,按仪器说明书操作。100株志贺菌流行株经血清凝集玻片法试验分为福氏志贺菌50株、宋内志贺菌50株[ 5]。

2. 药物敏感试验 所有菌株均严格按2007年美国临床实验室标准化协会(CLSI)的纸片扩散法检测其对11种抗菌药物的耐药性并判读结果[ 6]。

3. PCR检测质粒介导qnr基因并测序 (1)基因组DNA制备: qnr基因DNA制备参照文献[ 4];(2)PCR扩增: PCR 扩增体系50 μL,10×PCR 缓冲液 (25 mmol/L) 5 μL,双蒸水33.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)3 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,dNTP(10 mmol/L)上游引物(50 pmol/L)下游引物(50 pmol/L)各1 μL,DNA模板5 μL。PCR反应扩增条件:94 ℃ 30 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s, 共30个循环,72 ℃延伸7 min;(3)分析PCR产物:取10 μL PCR产物混合1 μL溴酚蓝,1.5%的琼脂糖凝胶(含溴乙锭)电泳,电压恒定为150 V 30 min,经Tanon-2500凝胶成像系统观察,如果出现明显的627 bp亮带即为qnr基因阳性;(4)测序:对qnr基因阳性菌株进行测序,测序结果均为闪晶生物公司提供。

4. 数据分析 采用WHONET 5.1软件进行统计分析。

三、统计学方法

将数据输入SPSS 11.0统计学软件,用χ2检验对福氏志贺菌和宋内志贺菌间耐药性及志贺菌qnr基因阳性和阴性菌株间耐药性分别进行比较;比较志贺菌qnr基因阳性和阴性菌株对氟喹诺酮药物抑菌圈中位数, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、耐药性检测结果

福氏志贺菌和宋内志贺菌的耐药性差异见 表1,志贺菌qnr阳性与阴性菌株对5种氟喹诺酮药物的耐药性比较见 表2,对5种氟喹诺酮药物抑菌圈中位数比较见 表3。

表1 福氏志贺菌和宋内志贺菌的耐药性差异
表2 志贺菌qnr阳性与阴性菌株对氟喹诺酮药物的耐药性比较
表3 志贺菌qnr阳性与阴性菌株对5种喹诺酮药物抑菌圈中位数比较(mm)
二、PCR扩增结果及测序

9株志贺菌检出qnr基因,片段长度为627 bp,见 图1。对qnr基因阳性菌株进行测序,经与NCBI基因库中qnr基因比对,吻合率为99%(RID: 8FC1Z54012)。

图1 部分菌株qnr基因PCR电泳结果

讨论

氟喹诺酮药物是第1个完全人工合成的药物,qnr基因是质粒介导的氟喹诺酮耐药基因,其编码的蛋白Qnr属于五肽重复家族,能够保护氟喹诺酮药物靶位点DNA解旋酶及拓扑异构酶Ⅳ,从而导致药物治疗失败。Martinez-Martinez等[ 7]研究发现携带质粒介导qnr基因明显提高了细菌的耐药水平,环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC)提高了32倍。质粒介导氟喹诺酮耐药是低水平的,qnr阳性的菌株可以表现出对氟喹诺酮抗菌药物敏感,这给qnr阳性菌株的检测带来了一定的困难[ 8],但其重要的临床意义在于qnr基因对染色体介导的氟喹诺酮耐药起重要的辅助作用,使细菌更容易发生高水平的耐药。

本研究收集的100株志贺菌用纸片扩散法检测其对11种抗菌药物的耐药性,发现其对多种抗菌药物普遍耐药,特别是对第1代氟喹诺酮药物耐药较高,对较新的氟喹诺酮药物则较敏感。比较福氏、宋内志贺菌可见,宋内志贺菌对氯霉素、诺氟沙星和环丙沙星耐药率(2.0%、0.0%和32.0%)明显低于福氏志贺菌的(82.0%、68.0%和68.0%, P<0.01)。推论原因可能是上海地区前几年福氏志贺菌较流行,而最早以前人们习惯用氯霉素来对抗腹泻,80年代开始诺氟沙星成为腹泻患者的首选用药,由此造成福氏志贺菌对氯霉素和诺氟沙星耐药很强。至于福氏志贺菌对环丙沙星的耐药率较高,可能环丙沙星作为常规用药用于临床较多,准确原因有待进一步研究。而仁济医院近几年宋内志贺菌检出较多,但耐药性变迁不大。

我们检测了100株志贺菌的qnr基因,其中有9株阳性,检出率为9%(9/100),福氏志贺菌为4%(2/50),宋内志贺菌为14%(7/50),宋内志贺菌质粒介导氟喹诺酮耐药qnr基因的携带率明显高于福氏志贺菌,说明志贺菌中由质粒介导引起的氟喹诺酮耐药qnr基因对宋内志贺菌所起的作用远大于对福氏志贺菌。

比较志贺菌qnr基因阳性和阴性菌株对氟喹诺酮药物的耐药率可见,两者无明显差异,这与文献报道一致[ 8]。qnr基因阳性菌株对氧氟沙星的耐药率(11.1%)高于阴性菌株(5.5%),但差异无统计学意义; qnr基因阴性菌株对环丙沙星的耐药率(51.6%)明显高于阴性菌株(33.3%),且差异有统计学意义,可能原因是福氏志贺菌对环内沙星中介耐药率高而qnr基因携带率低。qnr基因阳性菌株对5种氟喹诺酮药物的抑菌圈中位数比较均缩小,说明志贺菌若携带质粒介导qnr基因会导致对氟喹诺酮药物的敏感性下降,这与文献报道相符[ 8]。

总之,氟喹诺酮药物的临床应用很广泛, qnr基因的存在可使志贺菌在染色体介导氟喹诺酮药物耐药的基础上发生高水平耐药,且王明贵等[ 9]发现qnr基因水平转移比较频繁,易引起耐药播散,我们在今后的耐药监测工作中应重视qnr基因的出现。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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