引用本文
蒋燕群, 李俐, 钱燕斐. 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外排泵转录水平与耐药的关系. 2011, 26(1): 51-55
JIANG Yanqun, LI Li, QIAN Yanfei. Relationship between the level of efflux pump in Escherichia coli and Klebsiella pneumonia and drug resistance . Labratory Medicine, 2011, 26(1): 51-55  
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外排泵转录水平与耐药的关系
蒋燕群, 李俐, 钱燕斐
上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233

作者简介:蒋燕群,女,1952年生,硕士,主任技师,主要从事细菌耐药性研究。

摘要
目的

调查细菌耐药性与其主动外排泵系统的作用关系,并探讨大肠埃希菌外排泵调控基因对其外排泵结构基因表达水平的影响,分析其耐药机制。

方法

收集大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共59株,根据头孢他啶耐药情况分为实验组(耐药)与对照组(敏感),多重聚合酶链反应(PCR)扩增外排泵调控基因acrR并测序, 实时定量逆转录(RT)-PCR检测外排泵及调控基因marA的相对转表达水平,三维试验检测AmpC酶。

结果

实验组大肠埃希菌46.7%(7株)acrAB基因转录水平增高,肺炎克雷伯菌中51.9%(14株)acrAkp基因转录水平增高,敏感组外排泵基因均未见增高。实验组大肠埃希菌中,3株acrR发现突变,9株marA基因转录水平增高。59株菌株中39株(66.1%)AmpC阳性。

结论

主动外排泵系统是细菌耐药机制之一,常与其他耐药机制共同存在。acrR突变与marA表达增高均可引起大肠埃希菌acrAB表达增加。

关键词: 大肠埃希菌; 肺炎克雷伯菌; 外排泵; 耐药
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)01-0051-05
Relationship between the level of efflux pump in Escherichia coli and Klebsiella pneumonia and drug resistance
JIANG Yanqun, LI Li, QIAN Yanfei
Department of Clinical Laboratory,the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200233, China
Abstract
Objective

To investigate the relationship between bacterial resistance and its active role of efflux pump systems, explore the influence between the regulatory genes of efflux pump in Escherichia coli and the expression level of its structure gene, and analyze the resistant mechanism.

Methods

59 strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia were collected, and the strains were classified into two groups as experimental group and control group according to the resistance of ceftazidime. The multiplex polymerase chain reaction(PCR) was used for the amplification and seguencing of the regulatory gene acrR, and the real time (RT)-PCR was used for the detection of the expression level of efflux pump and the regulatory gene marA. The three-dimension test was used for the detection of AmpC beta-lactamase.

Results

7 strains of Escherichia coli (46.7%) had high acrAB transcription level in experimental group, and 14 strains of Klebsiella pneumonia (51.9%)had high acrAkp transcription level in experimental group. Among the Escherichia coli in experimental group,3 isolates had mutation of acrR gene, and 9 isolates had high marA gene transcription level. AmpC beta-lactamase was detected in 39 of 59 (66.1%) isolates.

Conclusions

The efflux pump system is one of the mechanisms of bacterial resistance, which often enhances the extent to resistance with other resistance mechanisms. The acrR mutation and increased expression of marA of Escherichia coli can cause the increasing of acrAB expression.

Keyword: Escherichia coli; Klebsiella pnenmonia; Efflux pump; Drug resistance
引言

细菌耐药一直是临床治疗遇到的棘手的问题, 其使诸多抗菌药物失去了应有的疗效, 这也是人们滥用抗菌药物所引发的新的问题。如何应对这一医学难题成了众多医疗工作者及科研人员关注的焦点, 产酶已被普遍认为是革兰阴性细菌耐药的主要机制, 例如ESBL和AmpC酶, 他们可以水解进入细菌体内的抗菌药物, 使其失去作用, 但是越来越多的研究者发现细菌耐药的产生并非是产酶这一单因素的作用结果[1], 特别是多重耐药株的出现。研究者[2]发现外排泵可以将多种抗菌药物排出体外, 降低胞内抗菌药物的浓度削弱其作用。因此, 外排系统进入了大家的视野, 细菌耐药机制也不仅仅归结为酶的水解作用。大肠埃希菌是发现药物外排泵最多的一种细菌, 但是在其约30种外排泵中AcrAB-TolC外排泵是最主要的。在对肺炎克雷伯菌外排泵的研究中发现, 其也具有与大肠埃希菌高度同源的外排系统, 因此, 将其命名为AcrAkpBkp-KocC外排泵, 与大肠埃希菌的外排泵具有相同的外排功能[3]。外排泵的高表达并非自发性的存在, 而是通过许多正向和负向调控基因的调控作用使然, 如正向调节因子MarA, 负向调节因子AcrR。本研究通过检测外排泵转录水平探讨外排泵在细菌耐药中的作用, 同时通过检测其调控基因分析耐药机制。

材料和方法
一、材料

1. 菌株

随机选取上海交通大学附属第六人民医院部分大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌共59株, 其中大肠埃希菌(ECO)24株, 肺炎克雷伯菌(KPN)35株, 根据细菌对头孢他啶耐药情况分为实验组(头孢他啶耐药)和对照组(头孢他啶敏感)。

2. 试剂

药敏纸片均购自Oxoid公司; 聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒、逆转录PCR反应试剂盒、实时定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司; 细菌总RNA提取试剂盒购自天根生物有限公司; 引物由上海生工公司和上海英骏公司合成。

3. 仪器

基因扩增仪(Eppendorf公司), WALKAWAY-40微生物鉴定药敏系统(Dada-Bering, Sacramento), 实时荧光定量PCR仪(LightCycler Real Time PCR扩增仪, 罗氏公司)。

二、方法

1. 药敏试验

采用纸片扩散法, 结果判定严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2009年制定的规则及标准判定。

2. 实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试验

用实时定量 RT-PCR 分别检测大肠埃希菌acrAB和肺炎克雷伯菌acrAkp的转录水平, 引物见表1。(1)提取细菌总RNA 完全按照天根生物有限公司细菌总RNA提取试剂盒的说明书进行操作, 主要步骤包括收集菌体、裂解细菌、去除蛋白质和DNA、溶解并收集总RNA、测RNA浓度; (2)将RNA逆转录成cDNA, 按照试剂盒说明书配置10 μ L反应体系, 在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s 的条件下进行反应, 反应产物做为模板进行下一步实时定量PCR; (3) 实时定量PCR 参照说明书配置20 μ L反应溶液, 使用两步法反应程序: 95 ℃ 30 s(20 ℃/s)1个循环; 95 ℃ 5 s(20 ℃/s)、60 ℃ 20 s(20 ℃/s)40个循环; 以16s rRNA为内参, 每个标本重复2次取均值, 并设空白对照; (4) 分别以大肠埃希菌ATCC 25922 和肺炎克雷伯菌ATCC 700603 为标准对照, 参照文献[4]推荐的方法进行分析。以标准菌株的膜孔蛋白转录水平为基准, 临床菌株与其比对。其中, 域值循环差(Δ CT)=目的基因CT值-内参CT值, 样本域值循环差(Δ Δ CT)=临床菌株目的基因CT值-标准菌株目的基因CT值; 2-Δ Δ CT即为与标准菌株相比cDNA的含量。

表1 PCR和 RT-PCR 引物

3. PCR检测acrR基因

热裂解法提取细菌DNA模板, 配置50 μ L体系的反应溶液, 引物见表1。0mpF PCR反应条件为94 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min 30个循环, 最后延伸72 ℃ 10 min, 并测序。

4. 三维试验

参照文献[5]对产AmpC酶进行确证, 主要步骤包括:(1)冻融法提取酶粗提物; (2)头孢西丁纸片贴于预接种有大肠埃希菌ATCC 25922的水解酪蛋白(M-H)琼脂平板中央, 酶粗提物加入纸片边缘5 mm处的放射状切裂缝内。

结果
一、药敏试验结果

实验组菌株对氨苄西林、舒巴坦、头孢克洛、头孢唑啉等有较高的耐药性, 对头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星等中度耐药, 对亚胺培南、美罗培南显示有较高的敏感性, 结果见表2。

表2 实验组菌株药敏结果(%)
二、外排泵基因转录水平检测

外排泵转录水平增高均分布在实验组, 其中大肠埃希菌实验组外排泵转录水平增高率为46.67%, 肺炎克雷伯菌实验组外排泵转录水平增高率为53.85%, 结果见表3。统计学分析结果见表4。

表3 外排泵结构基因及调控基因转录水平检测结果
表4 外排泵结构基因表达分析
三、acrR基因扩增并测序结果

对外排泵高表达的大肠埃希菌进行acrR基因的扩增, 在1 000bp均扩增出条带, 见图1。将这些细菌进行测序, 有3株存在基因突变, 结果见图2, 对以上3株突变菌株进行氨基酸比对, 见表5。

图1 acrR扩增产物电泳图注:电压100 V, 电流360 mA, 时间30 min; M为makerm, 1~4为实验组大肠埃希菌

图2 acrR基因测序结果比对图注:第1行为GeneBank中E.coli K-12, 第2行为E1, 第3行为E2, 第4行为E3

表5 氨基酸序列比对结果
四、三维试验结果

对59株细菌进行三维试验后得到39株阳性即产AmpC酶, 其中外排泵表达增高同时产AmpC酶有16株, 仅产AmpC酶23株, 仅外排泵表达增高5株, 既不产AmpC酶也无外排泵表达增高15株, 结果见表6。对这些细菌的耐药率进行综合分析显示外排泵和AmpC酶共同存在则耐药率高于单一因素造成的细菌耐药见表7, 对药敏试验抑菌圈进行统计学分析结果见表8。

表6 三维试验结果(株)
表7 头孢菌素耐药率分析结果(%)
表8 抑菌圈统计学分析结果
讨论

对随机选取的59株临床菌株进行药敏试验结果发现:亚胺培南、美罗培南有很强的抗菌作用(敏感率97%), 阿米卡星、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦的抗菌作用较强(敏感率41.8%55.2%), 而氨苄西林、舒巴坦、头孢克洛、头孢唑啉、哌拉西林的抗菌作用较差(敏感率0.0%9.0%)。因此, 应加强细菌耐药监测, 合理应用和优先选用低耐药性的抗菌药物, 避免产生或加重细菌的耐药, 以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。

大肠埃希菌中最主要的外排泵系统是AcrAB-TolC系统, 由膜融合蛋白AcrA, 外排转运蛋白AcrB, 外膜通道蛋白ToIC三部份组成。在肺炎克雷伯菌中也有类似于大肠埃希菌的AcrAkpBkp-KocC外排泵系统。AcrAB-TolC与AcrAkpBkp-KocC外排泵系统均属于耐药结节化细胞分化家族(RND), 其以质子的浓度梯度为能量对药物进行外排作用[6]。通过对大肠埃希菌acrAB基因和肺炎克雷伯菌acrAkp基因进行转录水平的检测发现, 对照组未发现外排泵表达增高。而实验组中无论是大肠埃希菌或是肺炎克雷伯菌外排泵高表达的菌株均占到一半左右。同时对2组外排泵cDNA相对表达量进行统计学分析, 差异具有统计学意义(P< 0.01)。由此可见, 外排泵在头孢他啶耐药组的细菌中表达增高的比例远远高于敏感组, 抗菌药物的高选择性压力下产生了这种适应性变异, 研究中发现并非所有实验组细菌外排泵表达都增高, 也说明外排泵并非导致细菌耐药的惟一原因。因此, 对所有细菌产AmpC酶的情况进行了分析, 在外排泵高表达的21株细菌中, 其中16株产AmpC酶, 外排泵非高表达的38株细菌中, 23株产AmpC酶。对这2种耐药机制的各种组合情况进行了耐药率的分析发现, 对于二、三、四代头孢菌素而言, 在单一因素存在的情况下, 外排泵高表达的细菌的耐药率略高于产AmpC酶的细菌, 而两者兼具的细菌的耐药率均高于前2种情况, 为了进一步分析其耐药率的差异, 对3种药物敏感试验的抑菌圈进行了统计, 结果显示差异具有统计学意义(P< 0.05)。可见产酶和外排泵高表达是两个独立的耐药机制, 当二者同时存在时耐药率显著升高, 同时也可认为细菌对多种药物耐药并非是单一因素作用的结果。

当大肠埃希菌的AcrAB-TolC外排泵过量表达时, 大肠埃希菌对许多药物的耐药性随之增强, 但当其过量表达超过一定水平时, 又可明显排出一些代谢中间产物而对菌体细胞产生毒性。因此, AcrAB-TolC外排泵的表达可能受到多种调控机制的影响而被有序的调控。AcrAB 的表达已知的调控因子有AcrR、MarA、MppA、RobA 和SoxS 等。AcrR通常以二聚体形式结合于AcrA基因和AcrB基因启动子附近的位点, 通过抑制AcrA和AcrB基因的转录, 防止其过量表达[7]。MarA则能特异性结合到acrAB基因的启动子附近, 增强RNA聚合酶与启动子的亲合力, 使转录起始的速率显著增加, 产生大量的AcrA和AcrB。其也以相同的方式上调TolC 的表达[8]。通过对大肠埃希菌外排泵调控基因acrR进行测序, 检测到3株发生基因突变导致氨基酸序列发生改变, 进一步将改变蛋白的结构, 最终使得其负向调控外排泵表达的作用丢失, 外排泵得以高表达。通过对marA基因转录水平的检测发现, 在9株表达水平增高的菌株中有6株同时存在外排泵的高表达, 可见marA表达增高对于acrAB表达有一定正向调控作用。但3株marA表达增高并未引起acrAB表达水平增高。由于MarA是一个多功能蛋白, 目前为止发现其可以调控60个基因的转录[8], 因此, marA表达上调并不一定引起外排泵的高表达。

总之, 面对各种类型的细菌耐药, 只有控制抗菌药物的滥用才能有效防止越来越多的细菌产生耐药。同时深入研究分析细菌耐药的机制才能对耐药菌株进行有效地防控。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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