引用本文
顾志冬, 吴倩文, 冯晓静, 林孝怡, 樊绮诗. 用于国产一步法HBsAg ELISA试剂及确认试验试剂的改进方法. 2011, 26(1): 32-35
GU Zhidong, WU Qianwen, FENG Xiaojing, LIN Xiaoyi, FAN Qishi. An improved method for home-made one step HBsAg ELISA reagents and its confirmatory test reagents. Labratory Medicine, 2011, 26(1): 32-35  
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用于国产一步法HBsAg ELISA试剂及确认试验试剂的改进方法
顾志冬, 吴倩文, 冯晓静, 林孝怡, 樊绮诗
上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025

作者简介:顾志冬,男,1973年生,硕士,副主任技师,主要从事免疫检验工作。

通讯作者:樊绮诗,联系电话:021-64370045-600619。

摘要
目的

延长酶反应时间以提高国产一步法酶联免疫吸附试验(ELISA)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)试剂的敏感性和精密度。

方法

将酶反应时间自30 min延长至120 min,观察检测结果的敏感性和特异性的变化,及其对相关确认试剂确认试验的影响,并与Murex确认试剂检测结果进行比对。

结果

酶反应时间延长至120 min,HBsAg ELISA试验检测的Cut-off值不变,在检测Murex HBsAg检测结果呈阴性反应的样本时,其结果均为阴性。延长酶反应时间至120 min可以提高检测结果的吸光度( A)值,位于灰区的弱阳性样本的 A值可提高1倍左右。常规ELISA结果S/CO值在0.5~1.0 区段的22例阴性灰区样本中,在酶反应时间延长至120 min的国产确认试剂检测中有4例样本确认为阳性,该4例样本在Murex确认试验中亦为阳性;S/CO值在1.0~2.0区段的79例阳性灰区样本中,120 min的国产确认试验与Murex确认试验均为50例阳性,2种确认试验结果一致(χ2 =0.078, P>0.05)。

结论

延长国产一步法HBsAg ELISA试剂的酶反应时间可以提高检测的敏感性并适用于相关的确认试验。

关键词: 乙型肝炎表面抗原; 酶联免疫吸附试验; 确认试验; 国产试剂; 酶反应时间; 敏感性; 特异性
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)01-0032-04
An improved method for home-made one step HBsAg ELISA reagents and its confirmatory test reagents
GU Zhidong, WU Qianwen, FENG Xiaojing, LIN Xiaoyi, FAN Qishi
Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To improve the sensitivity and precision of home-made one step hepatitis B surface antigen(HBsAg) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reagent by prolonging the enzyme reaction time.

Methods

The enzyme reaction time of home-made one step HBsAg ELISA reagent was prolonged from 30 min to 120 min, and the change of sensitivity and specificity as well as the influence of relative HBsAg confirmatory test reagent were observed. Murex confirmatory test was run in parallel to verify the sensitivity and specificity of the improved method.

Results

The prolongation of the enzyme reaction time from 30 min to 120 min did not alter the cut-off value of the HBsAg ELISA test. HBsAg negative samples primarily tested by Murex HBsAg test also showed negative results. The prolongation of the enzyme reaction time to 120 min increased the absorbance value ( A). The A value was almost doubled for the samples which were dropped in the grey zone. The result of the clinical trial of improved 120 min home-made confirmatory test comparatively with Murex confirmatory test revealed that among the samples of s/co value from 0.5 to 1.0 by routine HBsAg ELISA, 4 out of 22 samples were confirmed as positive by the improved home-made test and the Murex test. Among the samples of s/co value from 1.0 to 2.0 in the positive grey zone, 50 out of 79 samples were confirmed as positive by the improved for prolonging 120 min home-made test and Murex test. There was no statistical significance between the two tests( χ2 =0.078, P>0.05).

Conclusions

Prolonging the enzyme reaction time from 30 min to 120 min can improve the sensitivity of home-made one step HBsAg ELISA reagent, and is also suitable to the relative confirmatory test.

Keyword: Hepatitis B surface antigen; Enzyme-linked immunosorbent assay; Confirmatory test; Home-made reagent; Enzyme reaction time; Sensitivity; Specificity
引言

目前国内检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)最常用的试剂为国产快速一步法酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂(以下简称国产HBsAg ELISA试剂), 这种试剂的敏感性较低, 精密度较差, 因此在检测中会产生假阴性和假阳性结果。另外, 用国产试剂在阳性判断值(Cut-off Value, CO)附近, 会出现一个较宽的不能确定结果的“ 灰区” , 根据相关规定, 灰区结果必须进行复检才能报告[1], 但样本复检结果如仍落在灰区, 仍然难以对结果作出明确的判断。因此对国产HBsAg ELISA试剂检测结果为弱阳性的样本进行确认试验十分必要[2]。目前尚无国产HBsAg确认试剂问世。珠海丽珠试剂有限公司(以下简称丽珠公司)已研发出与其HBsAg ELISA试剂相应的确认试剂[3, 4], 经过临床应用研究取得了较为满意的结果[5]。

国产HBsAg ELISA试剂酶反应时间仅为30 min, 对方法的敏感性和精密度均产生不良影响。我们试将此反应时间延长为120 min, 敏感性得到明显提高。另外, 我们亦试将丽珠公司研发的确认试验的酶反应时间延长至120 min, 也得到满意的结果。

材料和方法
一、材料

1. 血清样本

取自瑞金医院2008年1月至2008年9月的常规体检样本[体检样本检测方法为科华生物技术股份公司(以下简称科华公司)的HBsAg诊断试剂盒(ELISA法)], 选择S/CO> 0.3的血清样本即刻置-40 ℃保存。试验时复融。在确认试验中用丽珠公司HBsAg诊断试剂盒(ELISA法)检测试剂作双份复检, 取结果平均值处于0.5≤ S/CO< 2的样本共101例用于本试验, 其中22例样本为0.5≤ S/CO< 1, 79例样本为1≤ S/CO< 2。

2. 试剂和仪器

丽珠公司的HBsAg ELISA 检测试剂盒:批号20081010; 美国雅培公司化学发光微粒子免疫(chemiluminescence microparticle immunoassay, CMIA)测定仪配套的HBsAg检测试剂, 批号为57313HN00; HBsAg确认试剂盒:(1)丽珠HBsAg确认试剂盒为丽珠公司研发的科研试剂[5](以下简称国产HBsAg确认试剂), 内含特异性乙型肝炎表面抗体(抗HBs)试剂、对照试剂和HBsAg 浓度为5 μ g/L的阳性参考品, 配以丽珠HBsAg ELISA检测试剂盒; (2)Murex HBsAg确认试剂盒(version 3), 批号L046011, 配以Murex HBsAg version 3检测试剂盒。主要仪器:DENLEY DRAGON公司酶标仪, 型号为WELLSCAN, MK-2; DEM-3洗板机; 雅培公司I2000SR CMIA检测仪, 序列号为ISR03025。

二、方法

1. 国产ELISA试剂检测HBsAg

按照试剂盒说明书进行操作, S/CO> 1.0即判为阳性。阴性灰区为0.5≤ S/CO< 1, 阳性灰区为1≤ S/CO< 2。

2. 酶反应时间延长的国产HBsAg ELISA试剂检测

使用国产HBsAg ELISA试剂盒, 操作按相应的说明书进行, 但酶反应时间从原法30 min延长至120 min。

3. 酶反应时间延长的国产HBsAg确认试剂检测

使用丽珠公司研发的HBsAg确认试剂盒[5], 操作和结果判断按相应的说明书进行(参见文献[5]), 但酶反应时间从原法30 min延长至120 min。

4.化学发光免疫测定检测HBsAg

参照雅培公司仪器和试剂盒说明, 由仪器自动检测并判断结果, HBsAg≥ 0.05 IU/mL判断为HBsAg阳性。

三、统计学方法

采用SPSS 14.0软件, 采用χ 2统计方法。

结果
一、国产HBsAg ELISA试剂酶反应时间延长至120 min的检测结果

1. 对CO值的影响

以试剂盒中阴性对照为样本, 进行酶反应时间30 min 和 120 min 的检测, 20孔平行实验, 计算检测的吸光度(A)值。 30 min反应的A值均< 0.05, 平均为0.024; 120 min 反应的A 值均< 0.05, 平均为0.039。按说明书计算CO, 两者均为2.1× 0.05=0.105。实验结果显示酶反应时间30和120 min的CO 值相同。

2. HBsAg阴性样本检测结果

取20份经CMIA方法检测结果为HBsAg阴性的人血清样本, 进行酶反应时间分别为30和120 min 的HBsAg ELISA检测, 双孔平行实验。结果显示, 进行30 min 酶反应时间时, 20份样本A值均< 0.05, 平均值为0.019; 进行120 min 酶反应时间时, 20份阴性样本中有19份A值< 0.05, 1份A值为0.068, 均远小于CO值。实验结果显示, 延长酶反应时间, 对HBsAg阴性样本检测结果无影响。

3. 对检测敏感性的影响

取HBsAg阳性混合人血清用乙型肝炎病毒(HBV)标志物均为阴性的人血清作适当稀释, 使其在HBsAg ELISA检测中结果的A值在0.5左右, 然后再作倍比稀释。取各稀释度的血清样本同时进行酶反应时间为30及120 min的HBsAg ELISA检测, 每份样本做双孔, 取平均值。结果显示, 酶反应时间延长至120 min, 低浓度HBsAg样本的A值可增加1倍左右。按CO值计算, HBsAg ELISA的敏感性可提高1倍(从稀释度1/8提高至1/16)。见表1。

表1 不同浓度HBsAg血清样本在酶反应时间分别为30和120 min的ELISA检测结果

4. HBsAg弱阳性样本2种方法的对比检测

对47份CMIA检测HBsAg为弱阳性结果(0.050~2.000 IU/mL)的样本同时进行酶反应时间为30及120 min的ELISA HBsAg检测。结果显示, 检测结果均为阴性的样本为15份; 均为阳性的样本为17份; 其余15份样本在酶反应时间为30 min时的检测结果为阴性, 在酶反应时间为120 min反应时检测结果为阳性。47例CMIA弱阳性样本中有32例(68.1%)可被酶反应时间为120 min的ELISA检出, 而酶反应时间为30 min的ELISA仅检出17例(36.2%)。酶反应时间为120 min的ELISA对弱阳性样本的检出率明显高于酶反应时间为30 min的ELISA(χ 2 =27.56, P< 0.001)。见表2。

表2 47份CMIA检测HBsAg为弱阳性血清样本在酶反应时间分别为30min、120min的ELISA检测结果
二、国产确认试剂酶反应时间延长至120 min的实验结果

对101例经丽珠HBsAg检测试剂检测结果在灰区的样本, 用丽珠确认试剂酶反应时间为120 min 的确认试验进行检测, 同时作Murex HBsAg确认试验进行比对。22例阴性灰区段样本中, 120 min丽珠HBsAg确认试验判为阳性的有4例, 此4例样本在Murex确认试验亦为阳性。另有1例120 min丽珠HBsAg确认试验结果为阴性, Murex确认试验结果为阳性。2种确认试验结果差异无统计学意义(χ 2 =0.078, P> 0.05)。见表3。

表3 120min丽珠HBsAg确认试验与Murex HBsAg确认试验检测结果
讨论

在ELISA测定过程中加入酶结合物后的作用时间与ELISA的敏感性有一定的相关性, 一般ELISA试剂盒采用1或1 h以上的酶反应时间。国产一步法ELISA HBsAg试剂则规定为30 min, 虽然快速简便, 但灵敏度低于进口试剂。本研究显示将国产试剂的酶反应时间延长至120 min, 其余均按说明书操作, 不会引起明显的假阳性反应。47例CMIA弱阳性样本用国产试剂检测的结果显示, 酶反应时间30 min的检出率仅有36.2%, 而延长至120 min后, 检测率可提高至68.1%。提示通过延长酶反应时间即可提高国产试剂的敏感性。表1的实验结果表明, 延长酶反应时间至120 min, 敏感性可提高1倍。由于S/CO值的增加, 也有助于提高检测的精密度。

另外, 在实际测定中, 如不用特殊的保温仪器, ELISA板从室温放入37 ℃保温箱中后, 板孔中的反应液尚需经过一段时间才能达到要求的温度, 因而实际的总反应效果低于30 min。由于每一次测定、保温条件有所不同, 因而可能导致批间精密度的减低。如将反应时间延长, 可以减弱这一影响。

丽珠公司研发的与其一步法ELISA HBsAg试剂匹配的确认试剂的临床应用研究取得了良好的效果[5], 特别在39份初检属阴性灰区的样本中有2份(5.13%)被确认为阳性, 表明弱阳性HBsAg的确认应包括阴性灰区的样本。本研究将此确认试验的酶反应时间延长至120 min, 对22份初检结果为灰区范围的样本作确认试验, 结果灰区阴性的样本被确认为阳性的为4/22(18.18%), 并与Murex确认试验结果相符, 表明酶反应时间延长至120min亦适用于相应的确认试剂。

本研究结果表明延长酶反应时间可改进现有的国产一步法HBsAg ELISA试剂及相应的正在研发的确认试剂的质量, 谨供生产单位参考, 希望在这方面作进一步的研发, 并早日向市场提供更适合临床应用的产品。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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