1.试剂和仪器 0.2 mol/L 2-Me应用液、0.08 mol/L DTT、多人份混合IgM抗A(效价64)血清、多人份混合IgG抗D(B型, 效价128)血清、临床IgG抗体血清(效价16~256)、pH值7.4磷酸盐缓冲液(PBS)均由上海市血液中心血型参比实验室提供; 抗人球蛋白试剂(单克隆抗IgG)和A、B、O型红细胞试剂由上海血液生物医药有限责任公司提供; 离心机为日产Kubota-2000型离心机; 水浴箱为DK-420s型恒温水浴箱。

2.方法 试验设计:用多人份混合IgG抗D和IgM抗A血清进行平行试验, 在不同的处理条件下, 检测IgG和IgM的效价。试验采用4个变量:(1)IgM破坏试剂:2-Me和DTT; (2)试剂浓度:2-Me(0.1、0.2 mol/L)和DTT(20、40、80 mmol/L), 与等量血清混合; (3)反应温度:22和37 ℃; (4)反应时间:5、10和30 min。反应结束后在盐水介质中测定IgM效价, 用Coomb's方法检测IgG效价。比较平行试验的结果, 以寻找最适宜的试验反应条件。

3.临床标本比较试验 用本试验所选定的最适反应条件与经典方法^[1]对42份临床标本作IgG效价检测的平行试验, 比较2种不同反应条件下检测结果的相符程度, 观察其用于临床批量标本检测的可行性。

使用2-Me(0.2 mol/L )/DTT(40 mmol/L )37 ℃水浴10 min裂解IgM抗体效果较好, 既兼顾IgG抗体效价测定, 又尽可能降低IgM效价; 间接抗人球法(IAT)致敏红细胞用37 ℃水浴30 min为宜。上述反应条件即为本研究所探讨的最适反应条件。见表1、2。

表1

表1

表1 2-Me处理血清试验条件 项目 37 ℃ 22 ℃ 0.2 mol/L 0.1 mol/L 0.2 mol/L 0.1 mol/L 5 min 10 min 30 min 5 min 10 min 30 min 5 min 10 min 30 min 5 min 10 min 30 min IgM效价 16 4 2~4 32 16 2~4 32 16 8 32~64 32 8 IgG效价 128 64~128 32~64 128 128 64~128 128 64~128 64 128 128 64~128

表1 2-Me处理血清试验条件

表2

表2

表2 DTT处理血清试验条件 项目 37 ℃ 22 ℃ 80 mmol/L 40 mmol/L 20 mmol/L 80 mmol/L 40 mmol/L 20 mmol/L 10 min 30 min 10 min 30 min 10 min 30 min 10 min 30 min 10 min 30 min 10 min 30 min IgM效价 < 2 < 2 < 2 < 2 8 4 < 2 < 2 8 4 32~64 16~32 IgG效价 64~128 64 128 64 128 64~128 128 64 128 64~128 128 128

表2 DTT处理血清试验条件

42份临床标本用经典方法和本试验所选定的最适反应条件做比较试验, 结果表明, 当标本IgG效价较高时, 两者所得结果更趋一致; 标本IgG效价较低时, 本试验条件下测得的IgG效价较经典方法略低, 总体上2种方法结果基本符合。见表3。

表3

表3

表3 2种试验条件下42份临床标本IgG抗体效价检测结果比对 方法 IgG 合计 1∶ 256 1∶ 128 1∶ 64 1∶ 32 1∶ 16 1∶ 8 经典方法 1 4 7 24 6 0 42 本试验条件 1 4 6 22 5 4 42

表3 2种试验条件下42份临床标本IgG抗体效价检测结果比对

IgG血型不规则抗体的检测对输血相关检测十分重要^[3]。人血清中抗A(B)往往是IgM和IgG混合物, 具有相同的特异性。要单独测定IgG抗A(B), 必须去除IgM抗A(B)的干扰。在基本不影响IgG抗体效价的前提下, IgM抗体裂解越彻底, 越能方便IgG抗体的检测。受检者血清用2-Me/DTT处理, 使IgM 抗体分子灭活并被裂解为6s-7s亚单位, 失去与相应红细胞凝集的功能; IgG抗体分子则不被2-Me灭活, 通过Coomb's试验可使红细胞凝集。

一般的文献建议用0.2 mol/L 2-Me 或0.01 mol/L DTT与等量血清混合后37 ℃温育2 h, 考虑到2-Me/DTT在破坏IgM抗体分子的同时也会破坏IgG抗体Fab段的二硫键, 使IgG抗体效价下降, 而且0.01 mol/L DTT处理血清虽然反应速度快, 但对强抗体灭活效果较差^[1], 本试验用0.2 mol/L 2-Me/40 mmol/L DTT 37 ℃水浴10 min处理血清结果较理想, 既能有效灭活IgM, 又能保持IgG较高效价, 有利于IgG抗A(B)的检出, 并且有效地缩短了操作时间。应用本试验条件与经典方法平行检测42份临床标本IgG抗体效价, 两者结果基本一致, 其是否适合临床大批量标本的检测, 值得做进一步的研究来证实。

反应条件的不足或过度都会使试验结果不理想, 合适的反应条件是试验成功的关键。本研究的目的是寻找合适的反应条件, 尽快检出免疫性IgG抗体及其效价, 减少检测误差, 并同样适用于其他红细胞血型不规则抗体的检出, 可评估不规则抗体的性状及输血反应的程度, 再用谱细胞(10个O细胞与自身红细胞组成)鉴定红细胞血型不规则抗体的特异性, 以寻找合格的血源, 从而降低输血风险。