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许耘川, 袁向亮, 沈立松. HPLC法测定血清甲氨蝶呤浓度的方法建立及其与荧光偏振法的比较[J].检验医学, 2015,25(9): 701-704
XU Yunchuan, YUAN Xiangliang, SHEN Lisong. An HPLC assay for the determination of methotrexate concentration in serum and its comparison to fluorescence polarization immunoassay[J]. Labratory Medicine, 2015,25(9): 701-704  
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HPLC法测定血清甲氨蝶呤浓度的方法建立及其与荧光偏振法的比较
许耘川, 袁向亮, 沈立松
上海交通大学医学院附属新华医院检验科,上海 200092

作者简介:许耘川,男,1984年生,学士,主要从事临床检验工作。

通讯作者:沈立松,联系电话:021-65790000-5100。

摘要
目的 建立测定血清甲氨蝶呤(MTX)浓度的高效液相色谱(HPLC)法,并与荧光偏振法(FPIA)作比较,评价其临床实用性。方法 血清样本经20%高氯酸沉淀蛋白质,吸取上清液进行HPLC分析。以MTX标准品外标法建立标准曲线,检测62例用药后患者血清MTX浓度,同时以FPIA测定。结果 HPLC法在0.049~25 ng/L内线性关系良好,日内及日间相对标准偏差(RSD)均<6%,最低检测浓度为0.025 ng/L。HPLC法和FPIA具有良好的相关性( r=0.973, P<0.01),2种方法测定值的差异无统计学意义( P=0.705)。结论 HPLC法具有便捷、准确、成本低等特点,与FPIA相关性良好,适用于临床MTX的血药浓度监测。
关键词: 甲氨蝶呤; 高效液相色谱法; 荧光偏振法; 治疗药物浓度监测
中图分类号:R979.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)09-0701-04
An HPLC assay for the determination of methotrexate concentration in serum and its comparison to fluorescence polarization immunoassay
XU Yunchuan, YUAN Xiangliang, SHEN Lisong
Department of Clinical Laboratory, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China
Abstract
Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) assay for the determination of methotrexate (MTX) concentration in serum and evaluate its application value by the comparison of fluorescence polarization immunoassay (FPIA).Methods The serum after deproteinization with 20% perchloric acid was determined by HPLC. The standard curve was established with outer standard assay with standardization of MTX. The concentrations of MTX in 62 patients were determined by FPIA.Results By HPLC assay, the linear range was 0.049-25 ng/L. The relative standard deviations (RSD) of intra-day and inter-day were both below 6%. The limit of determination quantitation was 0.025 ng/L. The result of HPLC assay was relative to that of FPIA( r=0.973, P<0.01). There was no significant difference between the results of two methods ( P=0.705).Conclusions The method of HPLC for determination of serum MTX concentration are convenient, accurate, high sensitive and low-cost. The results of determination are relative to those of FPIA, thus this method is suitable to monitor the blood MTX concentration clinically.
Keyword: Methotrexate; High performance liquid chromatography; Fluorescence polarization immunoassay; Therapeutic drug monitoring

甲氨蝶呤(methotrexate , MTX)为叶酸类抗肿瘤药, 通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶阻止四氢叶酸合成, 从而抑制肿瘤细胞增殖。临床上广泛用于治疗儿童淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌和骨肉瘤等恶性肿瘤。但大剂量时对非增殖细胞尤其是骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用, 且MTX在体内代谢存在明显个体差异, 因此需要对该药进行血药浓度监测。目前测定MTX血药浓度的常用方法是荧光偏振法(FPIA), 具有快速、易操作及样本无需前处理的特点, 但是其专用试剂盒价格昂贵且抗原抗体可能存在交叉反应[1]。而高效液相色谱(HPLC)法的专一性强, 可将药物本身与其代谢产物分离。本研究建立测定血清MTX浓度的HPLC法, 并与FPIA进行比较, 以探讨临床实验室开展HPLC法检测MTX血药浓度的可行性。

材料和方法
一、对象

选取62例上海交通大学医学院附属新华医院血液科经MTX化疗后44 h采集的血液样本。

二、仪器和试剂

岛津(Shimadzu)全自动HPLC仪, 包括SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20AC自动进样器、LC-20AD溶液传输单元、CTO-20AC色谱柱柱温箱和CBM-20A系统控制器。TDx血药浓度测定仪及MTX试剂盒均来自美国雅培公司。MTX标准品(Sigma-Aldrich公司); 乙腈(HPLC级); 冰醋酸(分析纯); 高氯酸(分析纯); 超纯水(Milli-Q纯水机制备)。

三、HPLC法

1.色谱条件 色谱柱为PLATISILTM C18柱(Dikma公司), 5 μ m, 250 mm× 4.6 mm; 流动相为乙腈∶ 3%冰醋酸=10∶ 90(V∶ V); 流速为1 mL/min; 进样量50 μ L; 柱温40 ℃; 紫外检测波长为306 nm。

2.样本处理方法 取血清样本150 μ L, 加20%高氯酸50 μ L, 漩涡混匀30 s, 14 000 r/min(离心半径9.5 cm)高速离心10 min。吸取上清液50 μ L进样。

3.标准血清及质控血清的制备 精确称量10 mg MTX标准品, 溶解于100 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液中, 制备成100 μ g/mL的MTX储备液。取正常人血清作为空白血清, 准确加入MTX储备液, 漩涡混匀, 得浓度分别为0.049、0.098、0.19、0.39、0.78、1.56、6.25、12.50、25.00 ng/L的标准血清。同法制备0.049、0.098、0.19、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25.00 ng/L的质控血清。

四、FPIA操作

血清样本加入样本盘中, 按TDx血药浓度测定仪操作指南进行。依次加入稀释剂、荧光标记物、特异抗体等试剂, 孵育约3 min, 计算机通过标准曲线拟合, 将荧光偏振值换算得到相应的浓度值, 输出结果。

五、统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以 x̅± s表示, HPLC法标准曲线由线性回归计算得出, 2种方法的相关性采用Spearman相关分析, 2种方法测得的血药浓度呈偏态分布, 经对数转换达到近似正态分布后采用配对样本t检验, P< 0.05表示差异具有统计学意义。

结 果
一、色谱结果

空白血清图谱在MTX出峰处背景干净, 无明显杂峰干扰; MTX峰形尖锐且分离良好[分离度(resolution, Rs)≥ 1.5]; MTX的保留时间为9.1 min。HPLC法的色谱结果见图1。

图1 HPLC法测定血清MTX的色谱图

二、标准曲线建立

取浓度分别为0.049、0.098、0.19、0.39、0.78、1.56、6.25、12.50、25.00 ng/L系列标准血清, 按HPLC法的样本处理方法处理后进样测定。以MTX浓度(X)为横坐标, 峰高(Y)为纵坐标绘制标准曲线。因MTX治疗浓度范围跨度较大, 为减少测定误差, 结合临床检测需要, 将标准曲线作两段处理。回归方程分别为Y1= 6 507.4X-9.4, r=0.999; Y2= 6 993.1X-647.8, r=1。表明本法的MTX检测浓度分别在0.049~0.78和0.78~25 ng/L范围内线性关系良好。

三、精密度试验

取0.049、3.13、25.00 ng/L的质控血清作为低、中、高3个浓度的样本, 按HPLC法的样本处理方法处理, 各浓度单日内重复测定5次, 计算日内相对标准偏差(RSD)值。另自配制样本之日开始, 每日取上述3个浓度质控血清测定5次, 计算日间RSD值, 结果3个浓度质控血清的日内及日间RSD均< 6%, 见表1。

表1 精密度试验结果
四、准确度试验

1.相对回收试验 取浓度分别为0.049、3.13、25.00 ng/L的质控血清各5份, 按HPLC法的样本处理方法处理, 测得峰高并将其代入回归方程, 求出实测浓度, 与其加入浓度的比值即为MTX的相对回收率, 结果见表2。

2.绝对回收试验 配制浓度为0.049、3.13、25.00 ng/L MTX水溶液与同浓度质控血清5份, 按HPLC法的样本处理方法处理, 记录各浓度水溶液和质控血清的MTX峰高。质控血清的MTX的峰高与相同浓度水溶液峰高的比值即为MTX的绝对回收率, 结果见表2。

表2 回收率试验 (%)
五、检测限

按信噪比(S/N)=3测得本法中MTX的最低检测浓度为0.025 ng/L。

六、HPLC法与FPIA测定结果的比较

62例患者样本HPLC法测定值为(0.172± 0.139)ng/L, FPIA测定值为(0.177± 0.138)ng/L。相关性分析表明2种方法具有良好的相关性(r=0.973, P< 0.01), 见图2。对2种方法结果进行配对样本t检验, 结果表明其差异无统计学意义(P=0.705)。

图2 HPLC法和FPIA测定血清MTX浓度的相关性

讨 论

检测方法的特异性是血药浓度监测方法评价的重要指标, 合并用药以及药物代谢产物是影响方法特异性的主要因素, 其中代谢产物因与原药性质相近故影响最大。研究发现, 7-OH-MTX及2, 4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)是MTX的主要代谢产物[2], 而在大剂量MTX化疗数小时后, 血液中7-OH-MTX浓度甚至会高于MTX原药[1], 因此最佳的MTX检测方法必需对原药具有高度专一性。目前MTX血药浓度测定方法主要有FPIA、酶倍增免疫测定法(EMIT)、放射免疫法(RIA)等[3], 其中FPIA应用较广。然而FPIA是基于抗原抗体竞争结合的免疫方法, 与MTX的主要代谢产物7-OH-MTX可能存在一定的交叉反应[2], 导致检测结果存在偏差, 而且该方法需要使用仪器配套试剂盒, 费用较高。HPLC法的最大特点是专一性强, 能够有效分离MTX原药及其代谢产物。本研究建立的HPLC法在对62例临床样本检测中, 在目标峰附近未检测出其他杂峰, 所以该测定方法能够基本排除其他药物以及代谢产物的干扰, 准确测定目标物。本研究发现部分样本在MTX峰后2 min左右会出现一代谢峰, 此峰是否为7-OH-MTX还需标准品对其进行定性分析, 而该物质的浓度高低对于FPIA的影响也有待进一步研究。

在HPLC法检测中, 样本的前处理方法至关重要。MTX血样的处理常用液液萃取法和直接沉淀法[4], 其中萃取法操作复杂、耗时, 且需要合适的内标物才能准确定量, 不适合用于实验室常规检测。本研究采用直接沉淀法[5, 6]并加以改良, 其操作简便、快速, 且能获得较高的提取回收率。通过预试验比较乙腈、甲醇、三氯醋酸及高氯酸4种蛋白沉淀试剂, 发现MTX不溶于乙腈、甲醇, 若使用以上2种沉淀剂会大大降低提取回收率, 影响检测限。沈佐君等[7]采用高效毛细管电泳法测定血清MTX浓度, 其最低的检测浓度为0.55 μ mol/L(0.25 ng/L), 该方法采用乙腈作为蛋白沉淀剂, 可能降低了提取回收率, 使得检测限偏高, 只能基本满足临床需要。使用三氯醋酸会产生较多杂峰, 影响结果。有研究显示, 使用高氯酸为沉淀剂, 能达到较好的蛋白沉淀效果且色谱图杂峰较少[5, 6]。然而在实验中发现, 血清经高氯酸处理后久置, 在MTX的保留时间附近会出现杂峰, 且无法与目标峰分离, 导致检测结果偏差很大。其原因尚不清楚, 其他文献也未曾提及, 可能是由于高氯酸的强氧化性导致MTX的理化性质发生变化。因此样本经处理后须在30 min内上机检测。

临床上一般认为44 h点和68 h点的血清MTX浓度是反映MTX 在体内排泄情况的指标, 关系到甲酰四氢叶酸钙(CF)解救剂量和解救次数的选择, 44 h< 1 μ mol/L(0.45 ng/L)、68 h< 0.1 μ mol/L(0.045 ng/L)为无毒性浓度, 超过上述浓度应追加CF解救[8]。本研究建立的HPLC法检测限低、线性范围广, 能够满足临床需要。如有需要, 本法也可用于测定MTX鞘内注射后脑脊液中的MTX浓度。相对于血清, 脑脊液中干扰物极少, 样本能够不经提取直接进样, 可大大提高回收率和敏感性, 其临床实用性有待研究。FPIA最低检测浓度为0.01 μ mol/L(0.005 ng/L), 本研究HPLC法的最低检测浓度为0.025 ng/L, 表明FPIA在检测限方面有一定优势。然而FPIA的线性范围较小, 如遇到高浓度样本时需要稀释并重复检测, 这无疑会增加检测成本及实验时间。通过对62例血清样本的测定, 发现在HPLC线性范围内2种方法测定值的相关性良好且差异无统计学意义, 结果可以相互替代。同时HPLC法的用血量以及整个样本分析周期也与FPIA相当。故HPLC法可以替代FPIA用于临床实验室对MTX血药浓度的检测。

本研究综合国内外各方法优点, 建立了测定血清MTX浓度的HPLC法。该法样本前处理操作简便、回收率高、色谱峰重现性好、检测时间短。较FPIA而言, 更具有专一性强、成本低等优点, 适用于临床实验室对MTX化疗方案的监测及药动学的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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