γ-谷氨酰基转移酶参考方法的建立与性能评估

引用本文

虞啸炫, 欧元祝, 居漪, 唐立萍, 王美娟, 李卿. γ-谷氨酰基转移酶参考方法的建立与性能评估[J].检验医学, 2015,25(9): 693-696
YU Xiaoxuan, OU Yuanzhu, JU Yi, TANG Liping, WANG Meijuan, LI Qing. Establishment and evaluation of the reference methods for gamma-glutamyltransferase[J]. Labratory Medicine, 2015,25(9): 693-696 复制到剪切板

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《检验医学》编辑部

γ-谷氨酰基转移酶参考方法的建立与性能评估

虞啸炫, 欧元祝, 居漪, 唐立萍, 王美娟, 李卿

上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介:虞啸炫,男,1986年生,学士,技师,主要从事临床生化参考体系标准化工作。

通讯作者:居漪,联系电话:021-68316300-2107。

摘要

目的建立γ-谷氨酰基转移酶(GGT)参考方法,对其性能进行评价,为临床常规检测GGT提供可比性和溯源性。方法根据国际临床化学联合会(IFCC)颁布的GGT一级参考测量程序(37 ℃)要求,建立GGT一级参考方法(其中包括所需仪器、试剂、样本的准备与校准等实验条件的试验),并对其进行精密度、准确性和最大线性范围检测。结果 GGT参考方法的精密度评价A、B 2个水平样本变异系数( CV)_总均<1%,符合精密度性能要求。有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)均值为113.27 U/L,均值与靶值的偏倚为-0.64%,在允许范围内。GGT的最大线性范围为413.81 U/L,高于IFCC公布的GGT参考方法的最大线性范围(276.40 U/L)。结论 GGT参考方法已基本建立,精密度、准确度及线性范围等性能指标均符合方法要求,为我国参考实验室网络的建立提供了基础,临床应用将更加广泛。

关键词: γ-谷氨酰基转移酶; 参考方法; 有证参考物质; 血清酶学

中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)09-0693-04

Establishment and evaluation of the reference methods for gamma-glutamyltransferase

YU Xiaoxuan, OU Yuanzhu, JU Yi, TANG Liping, WANG Meijuan, LI Qing

Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China

Abstract

Objective To establish and evaluate the reference method of gamma-glutamyltransferase (GGT) and provide the comparability and traceability of determining GGT routinely in clinical laboratory.Methods The reference method for GGT including the preparation and calibration of instruments, reagents and samples was established according to the documents issued by International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC). The precision, accuracy and linear range of the method were detected.Results According to the accuracy of GGT reference method, A and B horizontal samples were evaluated [total coefficient of variation ( CV_t)<1%]. For the reference material (ERM-AD452/IFCC), the average value was 113.27 U/L, and the bias between the average value and the target value was -0.64% within the allowance range. The upper limit of the linear range of GGT was 413.81 U/L,which was higher than the data published by IFCC (276.40 U/L ).Conclusions The reference method for GGT has been established basically. The analytic performance such as precision, accuracy and linear range conforms to the requirements. The reference method has been established, which can be used widely in clinical laboratory routinely and for research.

Keyword: Gamma-glutamyltransferase; Reference method; Certified reference material; Serum enzyme

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γ -谷氨酰基转移酶(GGT)作为肝胆系统疾病检出阳性率最高的酶, 备受临床关注。在现代检验医学中, 自动化的引入在临床化学分析中产生了深远的影响, 大大地提高了检测效率, 随着时代的发展, 人们除了要求检测效率之外, 也对检验结果的准确性提出了更高的要求, 而准确的依据是溯源至一级参考方法。参考方法是临床检验参考系统的主要组成部分, 也是标准化的基础。血清酶学参考方法的建立是为了实现患者样本检测结果准确, 具有可比性, 这是临床检验追求的目标。

材料和方法

一、材料

1. 仪器日本岛津(SHIMADZU)UV-2550型紫外/可见分光光度计; LAVDA E200型恒温水浴箱, 温控精度0.1 ℃, 无搅拌功能; Cole-Parmer公司ITS-90电子点温度计(精度为0.01 ℃)用于监测比色杯内温度; 瑞士Mettler Toledo公司AX205DR型电子天平(精度为0.01 mg); Mettler Toledo公司Inlab413 pH计(精密度为0.001); 德国Eppendorf公司 Reference型移液器; 移液管与定容容量瓶为德国Schott公司玻璃器皿(A级球形刻度移液管和A级容量瓶)。

2. 试剂实验所用试剂原料(N-甘氨酰甘氨酸、L-γ -谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺、单氨酸盐、一水化合物、NaOH和NaCl)均购自美国Sigma公司, 纯度均为分析纯。实验用水为美国Millipore超纯水(导电率< 2 μ S/cm、pH值6~7、硅酸盐﹤0.1 mg/L。)

3. 样本国际临床化学联合会(IFCC)参考实验室室间质评(RELA)比对样本(2008年度), 每次为A、B 2个浓度的冻干粉, 保存于-20 ℃; 有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)保存于-20 ℃; 日本临床检验标准协议会(JCCLS)旭化成株式会社酶标准品保存于-20 ℃; 高GGT患者血清样本与正常人血清保存于-80 ℃。

二、方法

1. GGT参考方法的建立根据IFCC发布的GGT参考测定标准操作程序(SOP)(37 ℃)^[1], 所用仪器紫外分光光度计、点式温度计、Eppendorf Reference型移液器、pH计、十万分之一电子天平及各种高精度玻璃器皿均送至上海市计量院进行校准, 并得到校准证书。试剂原料全部购自Sigma公司, 所有原料纯度为分析纯, 其质量由Sigma公司提供分析证明。实验用水达到要求, 试剂按照IFCC公布的SOP进行配制。通过预实验对建立的参考方法进行性能优化。

2. GGT参考方法的性能评估 (1)不精密度实验:参考《临床检验质量管理技术基础》(第2版)^[2], 在样本测定阶段, 每天在测定开始和结束时均需测定室内质控品(旭化成株式会社酶标准品), 严格监测整个测定过程的精密度; 在每天室内质控在控的情况下, 对2008年度RELA 2个水平浓度的样本进行连续4 d检测, 每天每水平检测5次, A、B浓度各20个检测结果, 经过统计学计算分别得出均值( $\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ )、标准差(s)和变异系数(CV); (2)准确性检测:对有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)进行检测, 在复溶之前保存于-20 ℃。按照说明进行复溶, 其参考值为(114.0± 2.5) U/L; (3)最大线性范围检测:参考美国临床实验室标准化研究所(CLSI)EP6-A文件及《临床检验质量管理技术基础》第2版^[2], 分别收集新鲜高GGT患者血清样本与新鲜正常人GGT血清样本, 高GGT患者结果作为高值(H), 正常人GGT结果作为低值(L), 随后按比例配成9个系列浓度样本(L、7L+H、6L+2H、5L+3H、4L+4H、3L+5H、2L+6H、L+7H、H), 每个系列样本重复检测2次, 取均值为各个系列样本的实测值。以X表示各样本序列, 以Y表示各样本的实测值, 将所有结果都点在折线图上。取9个系列浓度样本中结果在IFCC报道范围内的4个点数据进行线性拟合, 得到方程式Y^{^}=bX+a, 运用该线性方程计算其余5个点的数值, 作为理论值, 与对应的5个系列浓度样本实测值进行比较, 计算各点的相对偏倚。根据有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)文件所给出GGT偏倚范围[± 2.19%, 靶值范围(114.0± 2.5) U/L]以及GGT常规方法的允许偏倚(靶值± 20%), 确定本实验线性范围判断标准:线性拟合方程相关系数(r)≥ 0.999 9, 且各浓度点的实测值与理论值的相对偏倚< ± 2%。

结果

一、精密度实验

在每天室内质控在控的情况下, 连续4 d检测RELA 2个水平浓度的样本(2008年度)。各浓度复溶了2瓶样本。具体的GGT不精密度性能评价结果见表1。

表1 GGT参考方法的精密度评价

项目	测定次数	$\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ (U/L)	s	CV_天内 (%)	CV_总 (%)
预实验样本	9	87.87	0.61	0.63	0.69
样本A	20	203.04	1.70	0.54	0.84
样本B	20	183.15	1.82	0.49	0.99

表1 GGT参考方法的精密度评价

二、准确性实验

有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)参考值为(114.0± 2.5) U/L, 允许偏倚为± 2.19%。在完全按照要求进行保存和复溶后, 有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)的检测均值为113.27 U/L, 均值与靶值的偏倚为-0.64 %, 在允许范围内。

三、最大线性范围检测

用本实验室建立的GGT参考方法检测9个系列浓度样本的结果见表2。

表2 9个系列浓度GGT参考方法检测结果

按照上述最大线性范围检测的设计, 截取了9个系列浓度样本中的1~4号样本的检测结果做线性回归, 得出方程Y= 56.592X-37.63, 分别将5~8和9号样本序列号代入X中得出理论值, 并计算检测值与理论值的偏倚, 见表 3。除了第9号样本的相对偏倚超出± 2.0%外, 其余的样本号都在可接受的范围内。因此本实验室GGT参考方法的最大线性检测范围为413.81 U/L, 高于IFCC文件公布的最大线性范围(276.40 U/L)。

表3 样本的相对偏倚

讨论

为了实现血清酶检测结果有可比性、互通性和溯源性等多方面要求, 开展酶测定的标准化工作势在必行, 而酶学测定参考方法的建立是其中重要的一部分。

在GGT参考方法的建立中, 高精度的紫外可见分光光度计是关键设备, 由于本实验室在2006年开始正式启用, 购买的紫外可见分光光度计(日本岛津UV-2550)已经使用了3年, 其光源超过了使用寿命期限, 发出光源的能量不足, 导致一开始检测结果一直偏低。紫外可见分光光度计是监测每秒钟酶催化活性引起的吸光度的变化, 并且精确到小数点后4位。换言之, 对于参考方法测定中紫外可见分光光度计的要求和损耗都是非常高的。当长年累月的使用后, 光源已经不能达到我们的要求, 其结果自然是不可接受的。除此之外, 恒温水浴箱、电子天平、pH计、电子点温度计、移液器和容量瓶均对GGT参考方法的建立也起到至关重要的作用, 在之前许多国内外的学者都对此进行了详细的阐述。本实验室每年都会定期将以上设备送至上海市计量院进行校准, 得到校准证书。特别需要指出的是在GGT参考方法中温度的变化是波动的, 使得酶催化活性没有在相对统一的反应体系下进行, 由此产生的结果会出现一定的偏差。为保证能够精确掌握反应体系温度的变化, 将电子点温度计细小的探头置入比色杯中, 对比色杯内的温度变化达到了实时监测。

参考方法完全采用手工操作, 精确加样是保证测定结果精密、准确非常重要的环节。除了对移液器进行校准外, 实验操作人员本身也要达到一定的精准稳定, 否则每次加样残留在移液器里的样本或试剂较多, 会降低检测结果, 故实验操作应由固定人员进行。国际比对样本是冻干粉, 对复溶过程必须严格控制, 才能保证样本均匀和准确复溶, 冻干品的程序在文献[3]中有详细描述, 精确加样与冻干品复溶的严格控制都是保证结果准确度、精密度的重要前提。当然, 现在国际比对都是在全球范围内进行, 所以很多比对样本或者有证参考物质都是从国外长途运输过来, 我们很难能够预测这些样本在运输的途中是否会产生变化, 产生变化的量又是多少, 从而引起检测结果的变化, 这个问题有待我们进行更深一步的研究和调查。

从表1可以看出, 在GGT参考方法建立过程中, 达到以下3个要求:首先要拥有良好的操作技术, 在此基础上不断优化实验条件(如温度控制、加样手法等), 最后每天质控样本在控的情况下进行的不精密度实验、不准确度实验所得出的结果均较为稳定与准确。2个水平浓度样本CV_总< 1%, 国外优秀实验室室内不精密度大多< 1%, 有证参考物质(ERM-AD452/IFCC)检测均值在其靶值可接受范围内。最大线性范围也是反映参考方法性能评价的重要指标之一。表3显示本研究GGT的最大线性范围为413.81 U/L, 超过IFCC文件公布的GGT参考方法最大线性范围(276.40 U/L)。本实验室能够达到并超过IFCC公布的GGT参考方法最大线性范围, 主要原因可能为:(1)IFCC作为酶学参考方法最高权威组织, 为了能保证在全球范围内, 各个实验室的差异都被IFCC包含在内, 从而都能达到GGT参考方法最大线性范围的基线, 而对其结果有所保留; (2)移液器的精准度、紫外可见分光光度计的稳定性以及试剂的纯度等硬件条件大大提高, 从侧面支撑起了参考方法的性能。

GGT参考方法建立与性能评估完成后对于不确定度作了初步的评估, 不确定度的来源分为:(1)实验室可提供的方法性能数据(不确定度A类评定)主要来自测定方法、比对、现有的测定数据等; (2)没有被现有数据适当包括的分量(不确定度B类评定)主要来自设备生产厂商的报告、校准品和试剂的证书和/或来自文献资料等。不确定度评估中A类标准不确定度为重复测定结果的s平均误差; B类标准不确定度主要考虑了试剂的配制(称量、容量瓶定容、反应液pH值调节)中产生的不确定度, 移液器、移液管吸取液体产生的不确定度以及紫外分光光度计校准的扩展不确定度。试剂的配制、移液器、移液管吸取液体产生的不确定度考虑了校准与重复性因素, 可根据《化学分析中不确定度的评估指南》(QAUM2000)计算合成标准不确定度。但由于检测过程中影响分量太多且不易评价, 如稳定的影响、pH值的影响、分光光度计稳定性影响、实际消光系数与理论值的偏差、环境条件的影响等均无法简单评价, 故不确定度的评价需要进一步探究^[4]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[1]	Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of gamma-glutamyltransferase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(7): 734-738. [本文引用:1]
[2]	冯仁丰. 临床检验质量管理技术基础[M]. 第2版. 上海: 上海科学技术文献出版社, 2007: 138-170. [本文引用:2]
[3]	王涛, 齐丽丽, 刘海燕, 等. 六种临床诊断酶学测定参考方法的应用及国际比对结果分析[J]. 中华检验医学杂志, 2008, 31(3): 264-269. [本文引用:1]
[4]	倪育才. 实用测量不确定度评定[M]. 北京: 中国计量出版社, 2004: 204-205. [本文引用:1]

2002

0.0

... GGT参考方法的建立根据IFCC发布的GGT参考测定标准操作程序(SOP)(37 ℃)^[1],所用仪器紫外分光光度计、点式温度计、Eppendorf Reference型移液器、pH计、十万分之一电子天平及各种高精度玻璃器皿均送至上海市计量院进行校准,并得到校准证书 ...

2007

0.0

... GGT参考方法的性能评估 (1)不精密度实验:参考《临床检验质量管理技术基础》(第2版)^[2],在样本测定阶段,每天在测定开始和结束时均需测定室内质控品(旭化成株式会社酶标准品),严格监测整个测定过程的精密度 ...

... (3)最大线性范围检测:参考美国临床实验室标准化研究所(CLSI)EP6-A文件及《临床检验质量管理技术基础》第2版^[2],分别收集新鲜高GGT患者血清样本与新鲜正常人GGT血清样本,高GGT患者结果作为高值(H),正常人GGT结果作为低值(L),随后按比例配成9个系列浓度样本(L、7L+H、6L+2H、5L+3H、4L+4H、3L+5H、2L+6H、L+7H、H),每个系列样本重复检测2次,取均值为各个系列样本的实测值 ...

2008

0.0

. 2008, 31(3):264-269 DOI:doi:10.3321/j.issn:1009-9158.2008.03.006

六种临床诊断酶学测定参考方法的应用及国际比对结果分析

王涛, 齐丽丽, 刘海燕

目的应用国际临床化学联合会(IFCC)公布的参考方法对血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、(天)门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)及淀粉酶(AMY)6个酶进行测定,并通过参加参考实验室国际比对计划评估参考方法的准确性.方法按照IFCC有关酶学活性测定(37℃)参考方法的标准操作程序(SOP),分别使用PE和Agilent的两套测定系统进行6个酶的测定.通过测定质控血清监测两套测定系统的稳定状态、有证参考物(CRM)并参加酶学国际比对(ring trial),验证参考方法的准确性.结果两套系统测定室内质控血清的测值稳定,6种酶天间测定变异系数为0.5%～1.9%;测定结果一致,两者结果偏移小于2.1%;CRM测定结果在允许的范围内,初步验证了参考方法的准确性;高低两个浓度样本,两个独立系统的国际比对结果中有4个酶(ALT、AST、GGT、AMY)的测定值位于所有参考实验室测定的(x)±s范围内,LDH与CK测值位于(x)±2s之间;用稳健统计学方法评价,除了LDH的样本A测值属于离散值以外,其他5个酶ALT、AST、CK、GGT、AMY及LDH样本B的比对结果未发现离群.结论应用IFCC参考方法采用两套测定系统对6个酶进行的测定结果稳定、准确,具有等效性. Abstract： Objective To establish reference methods for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37℃ which have been published by IFCC and evaluate accuracy of reference methods.Methods Six reference methods for the measurement of catalytic activity of enzymes were established with two sets of apparatus systems of PE and Agilent according to International Federation of Clinical Chemistry(IFCC)37℃ reference procedures in two reference labs respectively.The commercial Roche calibrator c.f.a.s was used to monitor the precision of two reference labs as quality control material.Certified Reference Materials(CRMs)represented an efficient tool to assess the analytic performance for the verification of trueness and in two labs.The measurement accuracy of the assays for catalytic activity concentrations of 6 enzymes [alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),lactate dehydrogenase(LDH),creatine kinase(CK),gamma-glutamyhransferase(GGT),amylase(AMY)]was further verified and validated by international ring trial program.Results The within-laboratory variations of 6 enzymes in both of the reference lab were ranged from 0.5%-1.9%.Their results showed fully agreement with deviation less than 2.1%.The value of CRM was in the tolerant limit and analytic accuracy was verified.The results of four enzymes(ALT,AST,GGT,AMY)lay within (x)±s.However,the result of CK and LDH lay within (x)±2s.Except sample A for the LDH testing,we did not find any deviation variable in the detection of other enzymes.Conclusions The reference methods for the measurement of catalytic activity of enzymes(ALT,AST,LDH,CK,GGT,AMY)at 37℃ in the two labs by use of two sets of apparatus systems of PE and Agilent have been established and these methods showed excellent stability and accuracy.

2004

0.0

... 但由于检测过程中影响分量太多且不易评价,如稳定的影响、pH值的影响、分光光度计稳定性影响、实际消光系数与理论值的偏差、环境条件的影响等均无法简单评价,故不确定度的评价需要进一步探究^[4] ...