引用本文
陈敏, 盛跃颖, 张曦, 朱俊, 王刚毅, 陈洪友, 吴凡. 嗜肺军团菌血清1型上海环境分离株的脂肪酸成分分析及其应用[J].检验医学, 2015,25(9): 671-674
CHEN Min, SHENG Yueying, ZHANG Xi, ZHU Jun, WANG Gangyi, CHEN Hongyou, WU Fan. Cellular fatty acid composition analysis and application of Legionella pneumophila serotype 1 strains isolated from the environment in Shanghai [J]. Labratory Medicine, 2015,25(9): 671-674  
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嗜肺军团菌血清1型上海环境分离株的脂肪酸成分分析及其应用
陈敏, 盛跃颖, 张曦, 朱俊, 王刚毅, 陈洪友, 吴凡
上海市疾病预防控制中心,上海 200336

作者简介:陈 敏,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事病原微生物检验工作。

通讯作者:吴 凡,联系电话:021-62758710。

基金:上海市卫生局课题资助项目 (2007179); “十一五”科技重大专项(2008ZX10004-002)
摘要
目的 分析上海不同地区和场所分离的嗜肺军团菌血清1型(LP1型)的菌体脂肪酸组成成分,并探讨利用脂肪酸组成分析对实验菌株进行鉴定和分型的可行性。方法 应用气相色谱技术对36株LP1型上海环境分离株进行菌体脂肪酸成分分析,并利用MIDI公司的Sherlock软件系统对实验菌株进行鉴定和聚类分析。结果 36株LP1型上海环境分离株均被鉴定为嗜肺军团菌嗜肺亚种,其主要脂肪酸成分为异构16∶0酸、反异构15∶0酸、16∶0酸、2-羟基异构15∶0酸和w7c 16∶1酸。聚类分析结果为所有上海环境分离株的欧氏距离<10。结论 气相色谱法简便、快速,结合Sherlock软件系统可用于嗜肺军团菌的脂肪酸检测分析和鉴定。不同地区和场所分离的各实验菌株的脂肪酸组成无明显区别。
关键词: 嗜肺军团菌血清1型; 气相色谱; 脂肪酸
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)09-0671-04
Cellular fatty acid composition analysis and application of Legionella pneumophila serotype 1 strains isolated from the environment in Shanghai
CHEN Min, SHENG Yueying, ZHANG Xi, ZHU Jun, WANG Gangyi, CHEN Hongyou, WU Fan
Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China
Abstract
Objective To analyze the cellular fatty acid composition of Legionella pneumophila serotype 1 (LP1) strains isolated from the environment in Shanghai, and study the possibility of applying cellular fatty acid composition analysis to LP1 identifying and typing.Methods 36 LP1 strains isolated from the environment in Shanghai were collected and detected for cellular fatty acid composition analysis by gas chromatography. The identification and clustering of the strains were analyzed by MIDI Sherlock software system.Results All strains were detected and identified as Legionella pneumophila subsp. pneumophila, and the major cellular fatty acid compositions of these strains were iso 16∶0, anteiso 15∶0, 16∶0, iso 15∶0 2OH and 16∶1 w7c . According to the clustering analysis result, the Euclidian Distance of the environmental strains was <10.Conclusions Gas chromatography as a simple and rapid method can be used to detect the cellular fatty acid composition of Legionella pneumophila and to identify the species with MIDI Sherlock software system. All experimental strains reveal a high homogeneity.
Keyword: Legionella pneumophila serotype 1; Gas chromatography; Cellular fatty acid

军团菌是一类普遍存在于天然淡水、人工水域和土壤环境中的兼性胞内寄生菌。常用的基因及血清学分型方法将军团菌属分为48个种和70个血清型[1]。其中嗜肺军团菌是能引起人类疾病的常见菌种之一, 共15个血清型, 可引起人流行性、散发性和医院内获得性肺炎。而嗜肺军团菌血清1型(LP1型)是引起人军团菌获得性肺炎中最常见的血清型, 也是该属细菌的国内外重点研究对象之一。气相色谱技术是一种分离效能高、分析速度快的分析方法, 最早由埃伯尔(Able)应用于肠杆菌的菌体脂肪酸成分分析。本研究利用该技术对不同地区和场所的LP1型上海环境分离株的菌体脂肪酸成分进行系统分析, 以了解上海环境分离株的主要脂肪酸或特征性脂肪酸, 并探讨利用该方法对实验菌株进行鉴定和分型的可行性。

材料和方法
一、实验菌株的准备

36株军团菌上海环境分离株均为2007年5月至7月间从上海公共场所空调系统污染状况调查中分离获得, 并经生化试验、血清学凝集试验等鉴定为LP1型。菌株来源于宾馆17株、交通工具5株、娱乐场所2株、办公场所3株、运动场所1株、商场3株、饭店2株、医院3株。菌株地区分布为长宁区6株、黄浦区2株、静安区15株、卢湾区9株、浦东新区4株。2株嗜肺军团菌标准株(ATCC 33152、ATCC 33153)由上海市疾病预防控制中心菌种库提供。所有实验菌株接种于含L-半胱氨酸的缓冲液活性炭酵母琼脂(BCYE)培养基上, 置(36± 1)℃培养(72± 2) h。

二、实验仪器与分析软件

1.实验仪器 安捷伦HP6890气相色谱系统, 包括全自动进样装置、25 m HP-Ultra-2高效交联甲基硅酮弹性石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器(FID)。

2.分析软件 美国MIDI公司的Sherlock软件系统, 包括基于微生物细胞脂肪酸成分进行鉴定的系统MIS 4.5(microbial identification system )及进行建库分型的系统LGS Ver 4.5(library generation system version), 其中MIS 4.5系统中包含了24种军团菌的标准比照脂肪酸图谱。

三、方法

1.分析样品的准备 参照MIDI公司提供的标准化操作流程, 待测样品的准备包括收获细菌、细菌皂化释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的抽提与洗涤等步骤。

2.气相色谱分析 在下述色谱条件下分析标准品和待测样品:二阶程序升高柱温, 170 ℃起始, 5 ℃/min 升至260 ℃, 而后40 ℃/min 升温至310 ℃, 维持90 s; 汽化室温度250 ℃, 检测器温度300 ℃; 载气为氢气(2 mL/min), 尾吹气为氮气(30 mL/min); 柱前压68.95 kPa; 进样量1 μ L, 进样分流比100∶ 1。

3.结果判断及聚类图绘制 MIS软件系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分的存在, 并采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量, 再根据二者与系统中的标准图谱数值的匹配程度计算相似度指数(similarity index, SI), 最终给出1种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI值的菌种名称作为鉴定结果。应用LGS Ver 4.5 统计软件分析所得各实验菌株的脂肪酸组成, 并绘制实验菌株基于菌体脂肪酸成分的聚类图, 聚类方法为非加权配对平均法(uwpGA), 坐标为欧氏距离(Euclidian Distance)。

4.实验重复性 对36株上海环境分离株重复2次实验, 每次实验需包括2株标准菌株。每次上样分析以MIDI公司提供的标准品(标准脂肪酸甲酯混合物)作为仪器状态的质控。

结 果
一、实验菌株的脂肪酸组成分析

所有实验菌株的菌细胞脂肪酸气相色谱图相似, 典型的菌体脂肪酸图谱见图1。各菌株的主要脂肪酸组成情况见表1。LP1型上海环境分离株的主要脂肪酸成分为异构16∶ 0酸, 占总脂肪酸含量的30%以上, 其次是反异构15∶ 0酸、16∶ 0酸及本研究方法无法区分的2-羟基异构15∶ 0酸和w7c 16∶ 1酸。

图1 典型的嗜肺军团菌菌体脂肪酸的分析图谱

表1 36株LP1型上海环境分离株的主要脂肪酸成分
二、实验菌株的鉴定结果及基于脂肪酸组成绘制聚类图

根据MIS软件系统, 36株上海环境分离株和2株标准株均被鉴定为嗜肺军团菌嗜肺亚种。应用LGS Ver 4.5统计软件处理所有实验菌株的脂肪酸组成资料, 绘制其基于菌体脂肪酸成分的树状聚类图。见图2。

图2 LP1型的36株上海环境分离株和2株标准菌基于脂肪酸成分的聚类图

讨 论

除遗传学和表型的鉴定分型法外, 属于化学分类法之一的菌细胞脂肪酸分析法在近几年也逐渐成为微生物鉴定和分类的常用方法。该方法的建立基础是微生物的细胞脂肪酸组成一般较为稳定, 不受生化反应变异及质粒丢失等因素的影响, 且各种微生物都具有特征性的脂肪酸图谱, 即脂肪酸的种类和数量存在差异[2]。

军团菌属与其他微生物相比最为突出的特点是脂肪酸含量高, 这一生物学特点和结核分枝杆菌相似。本次研究中所有36株实验菌株通过本方法最多可检测到25种不同的脂肪酸, 其中含量最高的是异构16∶ 0酸, 其他主要脂肪酸分别为反异构15∶ 0酸、16∶ 0酸、2-羟基异构15∶ 0酸和w7c 16∶ 1酸。这几种脂肪酸占菌体总脂肪酸含量的60% 以上, 与文献研究结果基本一致[3]。

在分析菌体脂肪酸成分的同时, Sherlock系统的MIS 4.5软件可根据被测菌株的脂肪酸组成情况检索其内置的标准菌库, 给出种或亚种水平的鉴定结果。由于已建立的标准菌库的数据可能存在偏差(受菌株的地域来源和样品来源的限制或影响), 利用已有菌库给出的鉴定结果可能会与传统的鉴定结果出现不一致, 国内已有相关的研究报道[4]。因此本实验对该软件系统及已有标准菌库是否能对嗜肺军团菌国内分离株进行鉴定作了初步分析, 并尝试建立具有上海地域特点的菌株数据库。Sherlock系统在建立嗜肺军团菌的标准菌库时, 参照Brenner及其研究小组用DNA杂交法确立的分型及命名, 将嗜肺军团菌分为3个亚种, 分别是嗜肺亚种、弗氏亚种和牧场亚种[5]。在推荐的标准化实验条件下, 经过2次重复, 上海5个区8类公共场所分离的36株上海环境分离株和2株标准菌株均被鉴定为嗜肺军团菌嗜肺亚种, 而所有实验菌株的血清学鉴定结果为LP1型, 两者在种水平的鉴定结果一致, 初步说明利用气相色谱法和Sherlock系统内置标准菌库可以对上海市的嗜肺军团菌进行快速鉴定, 并能将菌株的鉴定时间缩短至3 h。目前, 由于传统血清学鉴定法易受到诊断血清质量及菌株间交叉反应等因素影响, 特别是在出现一些分离株无法用血清学或生化试验作出明确鉴定的情况下, 利用本实验方法进行嗜肺军团菌的鉴定是一种可供选择的新方法。

其次, Sherlock系统的LGS软件通过将各实验菌株的脂肪酸组成百分比归一化后编制成原始矩阵, 用统计软件处理后绘制聚类图, 可分析各实验菌株之间的相关性。由聚类分析图可见, 本研究分析的36株上海环境分离株之间的欧氏距离在10以内, 说明其脂肪酸成分极为接近, 具有明显的均质性。结合相关的流行病学资料, 我们发现上海不同地区和场所分离的各实验菌株的脂肪酸组成无明显区别, 聚类图不能充分体现各分离株在分离地区或场所上的差异。我们又采用脉冲场凝胶电泳分型技术和相应的分析软件将这36株上海环境分离株分为18个型别(具体数据未显示), 说明与分子生物学的分型技术相比, 脂肪酸成分分析法在嗜肺军团菌分型方面的应用前景还有待于进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Fields BS, Benson RF, Besser RE. Legionella and Legionnaires' disease: 25 years of investigation[J]. Clin Microbiol Rev, 2002, 15(3): 506-526. [本文引用:1]
[2] Able K, Deschmertzing H, Peterson JI. Classification of microorganisms by analysis of chemical composition. I. feasibility of utilizing gas chromato-graphy[J]. J Bacteriol, 1963, 85(5): 1039-1044. [本文引用:1]
[3] Diogo A, Verissimo A, Nobre MF, et al. Usefulness of fatty acid composition for differentiation of Legionella species[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(7): 2248-2254. [本文引用:1]
[4] 宋亚军, 郭兆彪, 张敏丽, 等. 鼠疫耶尔森菌中国分离株菌体脂肪酸成分分析[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2001, 21(4): 382-384. [本文引用:1]
[5] Brenner DJ, Steigerwalt AG, Epple P, et al. Legionella pneumophila serogroup Lansing 3 isolated from a patient with fatal pneumonia, and descriptions of L. pneumophila subsp. pneumophila subsp. nov. , L. pneumophila subsp. fraseri subsp. nov. , and L. pneumophila subsp. pascullei subsp. nov. [J]. J Clin Microbiol, 1988, 26(9): 1695-1703. [本文引用:1]