引用本文
高翔, 卢仁泉, 郭林. 一种血浆肿瘤型M2-丙酮酸激酶检测方法——酶联免疫吸附试验的临床评价. 25(7): 547-549
GAO Xiang, LU Renquan, GUO Lin. Clinical evaluation of a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of plasma tumor type M2-pyruvate kinase. Labratory Medicine, 25(7): 547-549  
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一种血浆肿瘤型M2-丙酮酸激酶检测方法——酶联免疫吸附试验的临床评价
高翔, 卢仁泉, 郭林
复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032

作者简介：高 翔,男,1963年生,学士,主管技师,主要从事临床检验和免疫学测定研究。

摘要
目的

评价一种血浆肿瘤型M2-丙酮酸激酶(TU M2-PK)检测方法——酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定性能和临床适用性。

方法

对新的自主开发的TU M2-PK检测方法进行偏倚测定、不精密度测定、回收试验以及对371例临床标本进行测定。

结果

TU M2-PK检测方法有良好的准确度(偏倚<5 U/mL)和精密度[变异系数( CV)<10%]。371份临床标本的TU M2-PK水平测定结果与“金标准”病理结果对照,TU M2-PK的敏感性和特异性分别为69.7%(106/152)和86.8%(190/219),准确度达到80.0%(296/371)。此外,该试剂盒所测得的恶性肿瘤患者的TU M2-PK水平明显高于良性肿瘤患者及正常对照者,差异具有统计学意义( P均<0.01)。

结论

TU M2-PK ELISA测定性能良好,具有较好的临床应用价值。

关键词: 肿瘤标志; M2-丙酮酸激酶; 酶联免疫吸附试验
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)07-0547-03
Clinical evaluation of a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of plasma tumor type M2-pyruvate kinase
GAO Xiang, LU Renquan, GUO Lin
Department of Clinical Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China
Abstract
Objective

To evaluate the methodological performance and clinical applicability of a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the determination of plasma tumor type M2-pyruvate kinase (TU M2-PK).

Methods

The bias, imprecision and recovery of the new TU M2-PK assay were determined, and 371 clinical samples were tested.

Results

The results of the TU M2-PK assay showed good accuracy (bias<5 U/mL) and precision [coefficient of variation ( CV)<10%]. Compared with gold standard pathologic diagnosis,the TU M2-PK levels of 371 clinical samples were analyzed. The sensitivity and specificity were 69.7%(106/152) and 86.8%(190/219),respectively. The accuracy was 80.0%(296/371). The TU M2-PK concentration in malignant tumor patients was significantly higher than that in benign tumor patients and healthy controls ( P<0.01).

Conclusions

The ELISA for the determination of TU M2-PK performs well and has the value of clinical application.

Keyword: Tumor marker; M2-pyruvate kinase; Enzyme-linked immunosorbent assay

目前, 恶性肿瘤发病率不断提高, 全世界每年死于恶性肿瘤的患者仅次于心脑血管疾病患者, 居第2位[1]。恶性肿瘤的基本治愈须依靠早期发现和及时治疗。但恶性肿瘤的早期诊断比较困难, 一方面临床上患者早期多无明显症状体征, 另一方面实验室缺乏理想的敏感而特异的诊断指标。肿瘤标志物检测简便且几乎无创, 临床上常通过其测定来诊断或监测肿瘤的发展。最近, 较多文献报道了一种新的肿瘤标志物— — 肿瘤型M2-丙酮酸激酶(TU M2-PK)可用于肾癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌等的筛查、诊断及跟踪治疗, 其价值得到临床的充分肯定[2~4]。但其临床测定试剂多为德国ScheBo. Biotech公司供应, 国内尚未见用于检测TU M2-PK的方法学研究报道。本研究对国内目前惟一自主开发的TU M2-PK检测试剂盒进行方法学考核, 并进行了临床的初步应用。

材料和方法
一、材料

1. TU M2-PK检测试剂盒 由深圳安群生物工程有限公司提供。其原理是采用了双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆标本中TU M2-PK水平, 即用纯化的鼠抗TU M2-PK抗体包被微孔板, 再向微孔中依次加入待测标本、兔抗人TU M2-PK抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG, 经过彻底洗涤后用底物3', 3', 5', 5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和标本中的TU M2-PK含量呈正相关。用酶标仪在492 nm波长下测定吸光度(A), 计算标本浓度。试剂盒规格为96T/盒, 有效期为6个月。

2. TU M2-PK标准液 TU M2-PK参考标准品由德国ScheBo.Biotech公司(目前全球惟一获得该项目注册批准)提供, 经含1% 牛血清白蛋白(BSA)的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) pH值7.2稀释成8、15、20、35、45和60 U/mL的系列浓度。

二、方法

1. TU M2-PK测定 TU M2-PK测定用双抗体夹心ELISA, 严格按试剂盒说明书操作, 在Triturus全自动酶免测定系统上测定。根据试剂盒的说明书, 以TU M2-PK> 15 U/mL为阳性标准。

2. 偏倚测定 浓度为8、15、20、35和45 U/mL的TU M2-PK标准液按测定方法进行测试, 根据测定结果与理论值之间的差异来计算偏倚和相对偏倚。偏倚值=实测浓度-理论浓度; 相对偏倚=│实测浓度-理论浓度│/ 理论浓度× 100%。

3. 线性范围测定 将安群公司提供的系列TU M2-PK标准液0、8、15、20、35和60 U/mL用此试剂盒按测定方法进行测定, 所得结果取半对数后用Excel软件绘制线性图。

4. 精密度测定 TU M2-PK试剂盒用2种浓度的标准品(15和35 U/mL)按测定方法各测20次, 所得结果计算变异系数(CV)。

5. 回收试验 取已用本法测定的含量分别为18.0和31.3 U/mL的血浆标本, 分别加入等体积的浓度为60.0 U/mL的标准品, 混匀后再进行测定, 计算回收率, 回收率=回收浓度/加入浓度× 100%。

6. 临床标本测定 血浆标本来自体检及肿瘤医院就诊的患者, 共371例, 其中恶性肿瘤患者152例, 良性肿瘤患者39例, 正常体检者180名。恶性肿瘤和良性肿瘤患者均由肿瘤医院病理科确诊。所有标本均空腹静脉采血1.5 mL, 加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝管, 混匀, 4 ℃ 1 500 r/min(离心半径为9.5 cm)离心10 min, 收集血浆-40 ℃冻存待测。以上所有标本均严格按测定方法进行测定。

三、统计学方法

数据统计分析用SPSS 13.0软件, 呈偏态分布数据以中位数及四分位数表示; 组间比较采用非参数Kruskal-wallis检验, 两两比较用Mann-Whitney U检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、偏倚测定

不同浓度的TU M2-PK标准液按测定方法进行测试, TU M2-PK标准液浓度为8、15、20、35和45 U/mL时, 偏倚均< 5 U/mL, 且相对偏倚均在10%范围内。见表1。

表1 TU M2-PK试剂盒测定偏倚结果
二、线性范围测定

TU M2-PK浓度为0、8、15、20、35和60 U/mL的标准液按TU M2-PK试剂盒的测定方法进行测定, 所得结果绘制工作曲线, 横坐标(X)为标准液浓度的对数值, 纵坐标(Y)为A值, 见图1。半对数的方程为Y= 1.233X-1.055, r2=0.980(P=0.002)。

图1 TU M2-PK检测试剂盒线性测定

三、精密度测定

2种浓度的标准品(15和35 U/mL)用TU M2-PK试剂盒各测20次, 计算的CV值分别为8.2%和9.1%。

四、回收试验

取已用本法测定的含量分别为18.0和31.3 U/mL的血浆标本, 分别加入等体积的浓度为60.0 U/mL的标准品, 混匀后再进行测定, 测定结果及计算得到相应的回收率见表2。

表2 回收试验结果
五、临床标本测定

371份临床标本的TU M2-PK水平测定结果见表3, 与“ 金标准” 病理结果对照, TU M2-PK的敏感性和特异性分别为69.7%(106/152)和86.8%(190/219), 准确度为80.0%(296/371)。统计分析也表明, 该试剂盒所测得的TU M2-PK水平3组之间的差异具有统计学意义(ψ 2=66.625, P< 0.01), 且恶性肿瘤患者的TU M2-PK水平明显高于良性肿瘤患者及正常对照者, 差异具有统计学意义, (U=1 564.5、6 789.5, P均< 0.01)。

表3 各组血浆测定TU M2-PK水平结果
讨 论

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径的一个关键酶, 有4种同工酶, 分别为L型、R型、M1型和M2型, 均为具有高度活性的四聚体。恶性肿瘤发生时, 在癌基因编码的激酶催化下, M2-PK大量表达且其Ser和Tyr位点发生磷酸化, 原先的四聚体解离为二聚体形式, 称为TU M2-PK [5, 6]。TU M2-PK在肿瘤细胞中往往明显过表达。早在1993年德国Hamburg召开的第7届肿瘤标志研讨会上, TU M2-PK第1次作为一种新的肿瘤标志物被提出。

由深圳安群生物工程有限公司提供的TU M2-PK测定试剂盒与德国Schebo试剂盒相比具有价格低, 且能保证在测定范围内有良好的准确度(偏倚< 5 U/mL, 相对偏倚均< 10%)和较好的精密度(CV< 10%); 另外, 标准曲线也有一定的宽度和斜率, 0~60 U/mL浓度范围的r值不低于0.98, 符合剂量反应工作曲线的要求[7]。此外, TU M2-PK参考标准品所作实验证明该试剂盒能够定量, 良好的回收率(90.3%108.3%)也证明了这一点。

371份临床标本测定结果与“ 金标准” 病理结果对比研究发现, TU M2-PK检测的敏感性和特异性可达到69.7%和86.8%, 这与国内外文献报道基本一致[8]。而且其准确度可以达到80.0%。限于目前实验条件, 本实验仅选择与“ 金标准” 结果对比, 而与同类进口产品的对比测定研究还需在以后的实验中开展。TU M2-PK与肿瘤细胞的无限增殖密切相关, 作为一个相对“ 广谱” 的肿瘤标志物, 我们的实验表明该血浆TU M2-PK的ELISA检测试剂盒在肿瘤筛查特别是高危人群中有一定的应用价值。此外, 该指标临床上不同种类的恶性肿瘤适用性比较即临床应用价值的具体比较, 我们将作进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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