临床标本可选用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液(BAL)、脑脊液或其他无菌体液。血液标本由于获取方便、可重复采集、不易污染等特点而较多地运用于检测。Cuenca -Estrella 等^[4]对有侵袭性曲霉病危险因素的83位患者每周2次分别取血清和全血标本, 应用实时荧光定量PCR对2 244个标本进行检测, 发现血清和全血标本对于侵袭性曲霉病的诊断作用无明显差异, 认为这2种标本具有相似的诊断价值。Cruzado等^[5]则不推荐使用血浆或全血, 认为应该使用血清标本以消除抗凝剂对PCR检测的干扰。Garcia等^[6]专门研究了不同抗凝成分对PCR检测曲霉的影响, 发现同样的PCR反应条件下血清和EDTA抗凝全血为阳性结果, 而使用肝素及枸橼酸抗凝时为阴性, 故认为不同抗凝剂成分对PCR检测存在不同程度的干扰作用。

BAL对于早期诊断侵袭性曲霉病则更有价值, 因为曲霉首先是通过空气传播吸入引起肺部感染, 随后抗原入血。Tuon^[7]对1980至2006年收集的BAL标本进行PCR检测以诊断侵袭性曲霉感染的研究进行Meta分析, 在入选的15篇研究中发现许多研究结果PCR的特异性接近100%, 总特异性为94%, 但敏感性较低且变异大, 其平均值仅79%, 并且BAL作为PCR检测的临床标本诊断侵袭性曲霉病其采样方法具有创伤性, 因此其应用受到一定限制。

目前有商品化试剂盒可提取真菌DNA, 方便、快速。随着DNA自动化提取技术的发展, 可以排除真空泵、离心机和其他手工步骤对标本的交叉污染, 降低PCR反应的假阳性。另外, 抽提DNA时所用标本量对于PCR检测结果也有一定影响。Suarez等^[8]在2008年的研究中比较100 μ L和1 mL血清标本中烟曲霉的检出, 发现增加血清含量进行DNA抽提, 可提高烟曲霉检出的敏感性和阴性预测值, 而不影响其特异性及阳性预测值。

目前, 真菌核酸序列研究主要集中在rDNA基因上, rDNA具有广泛的保守区域, 可作为引物的结合位点, 并且在保守区内存在各菌种不同的可变区, 可对其设计不同的特异性引物或探针直接鉴定至种或群。

核糖体rDNA一般由转录区和非转录区构成。转录区包括5S、5.8S、18S 和28S rDNA , 其中18S、5.8S 和28S rDNA 基因组成一个转录单元, 产生一个前体RNA。内转录间隔区(ITS)位于18S 和5.8S rDNA (ITS1) 之间以及5.8S 和28S rDNA (ITS2)之间。18S rDNA和28S rDNA序列中既有保守区又有可变区, 在进化速率上比较保守, 是生物进化系统分类的良好标记。5.8S基因相对分子质量小且高度保守, 较少用于系统学研究, 但其为真菌rDNA PCR扩增的通用引物设计提供了极大的方便。Henry 等^[9]将6种临床分离的曲霉及其标准菌株的5.8S rDNA基因序列进行比较, 发现其种间差异< 1%。

而ITS由于不加入成熟核糖体, 所以受到的选择压力较小, 进化相对迅速而具多态性。同时ITS序列长度适中, 使人们可以从不太长的序列中获得足够的信息, 可广泛用于属内、种间或种内群体的系统学研究^[10]。

此外, 检测的靶基因还有单拷贝的肌动蛋白(actin)或热休克蛋白(HSP 90) 基因、线粒体DNA等。

根据临床不同的目的和要求, 可选用不同的PCR扩增方法。1993年Spreadbury等^[11]首次尝试了应用PCR检测烟曲霉, 以保守的26S rDNA基因间隔区(intergenic spacer region, ISR)为靶序列设计引物, 成功扩增出401 bp的片段。但普通PCR由于开放的操作过程而存在污染的可能, 使其假阳性较高且无法克服, 检测过程也无统一规范; 同时, 普通PCR只能检测标本中是否存在特异性靶DNA或RNA分子, 而无法确定其相对含量, 故目前PCR尚未被接受为IFI的诊断方法。近年来, 在利用PCR原理的基础上衍生出许多改良技术, 增加了该技术的敏感性和特异性, 具有较好的应用前景。

1. 巢式PCR 巢式PCR是指在目的基因序列中分别设计相套的2对引物(内引物和外引物), 内引物扩增的片段是外引物扩增片段的一部分。在实验过程中, 先用外引物进行一次普通PCR, 用这次PCR的产物作为模版, 用内引物进行第2次PCR, 达到进一步富集目的基因的目的。其克服了单次扩增“ 平台期效应” 的限制, 使扩增倍数提高, 同时降低了扩增多个靶位点的可能性(同2套引物都互补的靶序列很少), 从而极大地提高了PCR的敏感性。 Kanbe 等^[12]设计特异性探针运用巢式PCR检测曲霉, 发现烟曲霉的最低检测限达100 fg, 且可以从各种临床标本中扩增出烟曲霉特异性DNA片段。但巢式PCR进行第2次PCR扩增引起交叉污染的概率较大, 因此可利用内外引物熔解温度(Tm)值不同, 在同一反应管中进行扩增, 以减少污染。

2. 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出, 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃, 而且与常规PCR相比, 其具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点, 目前已广泛应用于真菌研究。Cuenca -Estrella 等^[4]对有侵袭性曲霉病危险因素伴中性粒细胞减少患者的前瞻性研究发现, 以连续2次阳性结果作为PCR阳性的判断标准, 实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为91.6%、94.4%、73.3%和98.5%。应用CART软件分析发现, 应用实时荧光定量PCR诊断侵袭性曲霉病分别比高分辨解剖结构显像(HRCT)及血清GM试验提早21及68 d, 可见实时荧光定量PCR对于曲霉菌感染早期诊断具有重要作用。金欣等^[13]利用LightCycler仪器建立了一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法, 用于系统性曲霉感染的快速检测。其通过微机控制, 实现了对PCR扩增产物的实时动态监测和结果自动分析, 不需要对PCR产物进行后续处理, 还做了相应的熔解曲线, 根据标本熔解曲线有无峰及峰的位置可判断标本有无特异性扩增, 从而克服PCR可能有假阳性结果的缺点; 并且证实了他们建立的PCR体系有良好的特异性和敏感性, 其烟曲霉DNA检测下限可达到10 fg。

3. 多重PCR 多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR, 是在同一PCR反应体系内加上2对以上引物, 同时扩增出多个核酸片段的PCR检测方法。Logotheti 等^[14]对临床常见的烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉及土曲霉分别设计了4对特异性引物, 将其加入同一PCR反应管中进行扩增, 扩增片段的测序结果表明烟曲霉和土曲霉与GenBank中相应片段序列一致性为100%, 黄曲霉和黑曲霉则分别为99%和95%, 且设计的引物对与人类DNA无交叉反应, 并能不受全血标本中潜在PCR抑制物质的影响。多重PCR可同时检测并鉴定多种深部真菌, 但与常规PCR相比, 多重PCR涉及多对引物, 增加错配扩增产物的机会, 因此需要根据实验的要求、目的及设计的引物等因素寻找最优扩增条件。

4. 竞争PCR 竞争PCR须先构建一个与靶基因有相同的扩增效率和引物结合位点的内标, 但探针结合位点不同。在同一反应管内, 靶基因及内标物与引物竞争性结合, 进行同步扩增。由于竞争作用, 当一种模板扩增产物逐渐增加时, 另一种模板的扩增产物相对减少, 但2种扩增产物的比值与初始状态时2种模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线, 从而进行准确的核酸定量。采用竞争PCR检测曲霉感染的报道较少。Bretagne 等^[15]运用竞争性PCR检测支气管灌洗液中的曲霉DNA, 结果发现该技术对于有曲霉病危险因素的患者的阳性预测值较低(仅20%), 又由于含有曲霉孢子的临床标本及反应液具有较高的污染危险, 因此其认为该PCR是否应用于曲霉病常规诊断还需进一步研究。

1. 琼脂糖凝胶电泳 将10~20 μ L PCR 扩增产物在含有0.25~0.5 μ g/mL溴化乙啶(EB) 的琼脂糖凝胶中电泳, 在紫外(一般302 nm) 条件下可观察到特异性的荧光条带。PCR产物的大小应与预计设定的片段一致。

2. 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 限制性酶切分析是用某种限制性内切酶消化PCR扩增产物后再进行电泳, 由于各扩增产物的DNA序列不同, 限制性内切酶针对特定位点进行消化后, 便有其特定消化片段, 观察消化片段的数目及大小, 从而可以在种间分型或鉴别。 Staab等^[16]发现曲霉属中烟曲霉、A.lentulus及N.udagawae难以靠形态学区分, 而通过PCR扩增其编码β 微管蛋白的benA基因, 将其产物经Bccl酶切, 烟曲霉可产生249、144、99 bp 3条片段; A.lentulus可产生348、105、39 bp 3条片段; N.udagawae可产生347、60、46、39 bp 4条片段, 从而很好地区分这3种曲霉。

3. 探针杂交(Southern) 其基本原理是将待测的DNA标本固定在固相载体上, 与标记的核酸探针进行杂交, 在与探针有同源序列的固相DNA位置上显示出杂交信号。通过探针杂交可以判断被检测的DNA标本中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度, 可鉴定到种, 其敏感性比电泳提高一个数量级。但该技术操作比较繁琐、费时, 且影响因素较多, 如DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

4. PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA) 即在PCR扩增以后, 在微孔板上借用ELISA的原理, 使用酶标抗体进行固相杂交来实现相对定量。PCR-ELISA有较好的敏感性和特异性, 对仪器要求也较低, 但该法容易引起假阳性, 且其显色定量分析相对于探针荧光分析, 无论是敏感性还是特异性都有差距。Badiee 等^[17]用PCR-ELISA早期诊断肝移植患者中IFI, 其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为83.3%、91.7%、76.9%和94.3%。Scotter 等^[18]比较PCR-ELISA及血清GM试验对曲霉感染诊断中的作用, 发现前者敏感性较高而后者的特异性较高; PCR-ELISA的假阳性率明显高于GM试验(分别为8%和0.4%), 这可能与ELISA的开放性, 尤其是洗板时很容易产生污染有关。

5. 斑点杂交(dot biot hybridization) 斑点杂交是指将DNA或RNA标本直接点在硝酸纤维素滤膜上, 然后与核酸探针分子杂交, 以显示标本中是否存在特异的DNA或RNA。同一种标本经不同倍数的稀释, 还可以得到半定量的结果, 所以其是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法。王莉等^[19]通过PCR扩增曲霉28S rRNA保守序列, 结合4种标记-biotin的曲霉种特异性探针进行斑点杂交, 成功鉴定临床常见的曲霉, 并可能检测到这4种真菌的混合感染, 具有很好的应用前景。

6. 测序法(sequencing) 测序法是将PCR产物经克隆后测序或直接对PCR产物进行测序, 是所有检测方法中最灵敏、最全面、特异性最高的方法, 但测序法所需的仪器和费用昂贵, 使得其并没有在临床诊断中得到普及, 一般用于科研。

曲霉广泛地存在于自然环境中, 而PCR具有较高的敏感性, 因此实验过程中必须严格控制环境中曲霉的污染。常用于控制PCR实验室污染的方法有:设立阴阳性对照、严格实验室分区操作、仪器消毒、正确的试剂配制与储存等。脱氧尿嘧啶(dUTP)/尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)技术可减低PCR反应的假阳性, 即将普通PCR反应体系中dUTP 代替部分三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP), 加入UDG酶并增加2 min 3750 ℃的保温步骤, 即可消除以往PCR产物的残留污染, 由于UDG酶不耐热, 可通过热变性失活, 不影响新扩增的PCR产物, 是一种较好的避免假阳性的方法^[20]。

目前侵袭性曲霉病的实验室检测方法已较多, 但PCR可早期诊断真菌感染, 避免盲目的抗真菌治疗, 减少治疗毒性, 及时监控抗真菌治疗的疗效。随着实验室检测技术的提高, PCR将会更好的用于曲霉病的诊断。