PCR技术以其敏感(1个DNA拷贝经PCR扩增周期可放大为10⁶)被广泛接受与应用, 但是PCR前的DNA提取和靶基因的浓缩所起的重要影响作用已深入人心。因忽略临床标本检测中DNA的提取而造成99%的真菌DNA在提取过程中丢失, 大大降低了PCR的敏感性^[5]。因为真菌的细胞壁结构要比哺乳动物和细菌的细胞壁复杂, 其包含了大量聚糖[α -或β (1-3)葡聚糖、半乳甘露聚糖等]、几丁质、糖蛋白、脂质和肽类等, 常规用于抽提病毒和细菌DNA的方法不能有效的提取到真菌DNA。Karakousis等^[6]曾比较了物理、化学、酶法、机械研磨法以及商品化试剂等对于16种医学相关的真菌标准株的DNA提取效率, 最终得出结论是在他们的实验室条件下, 单细胞真菌和多细胞真菌间存在很大的差异性。尤其对于曲霉中的烟曲霉, 最好用含有蛋白酶K或溶壁酶的山梨醇缓冲液加上物理研磨等手段, 才能有效地提取真菌DNA(> 70%~80%), 其重复性也比较好。Francesconi等^[7]则报道利用自动化检测仪(MagNA Pure LC system)和手工提取法分别比较了从兔子的肺泡灌洗液(BAL)中提取烟曲霉和米根酶的孢子及菌丝DNA的提取效率。结果显示, 这2种方法对于烟曲霉孢子和米根酶菌丝的核酸提取具有相似敏感性; 自动化检测对于米根酶囊孢子核酸提取效率更高, 而手工法对于米根酶菌丝核酸提取更敏感。国内学者们的相关报道不少。新近, 吴发红等^[8]报道分别比较CTAB(一种化学试剂)法、十二烷基磺酸钠(SDS)法以及改良的CTAB法提取实验室培养的真菌菌株, 他们的结论是改良的CTAB法所获得的真菌DNA不仅产量高而且比较纯。临床实验室检测涉及到患者直接送检的标本, 尤其处于疾病发病的早期阶段, 其标本中含有少量的病原体DNA。因此, 如何有效地获取病原体DNA成为开展真菌PCR检测的瓶颈。

临床检测分析真菌病原体标本的选择与该病原体引发宿主感染的特征密切相关。研究资料显示IFD大多由吸入大量病原体孢子所致, 所以呼吸道标本尤其是BAL为首选。事实上, BAL的收集具有侵袭性, 不可连续动态检测, 不易被临床接纳; 采用血液作为标本来源, 从全血到不含细胞成分的血清或血浆都被用于检测真菌PCR, 说明真菌DNA存在游离的或细胞相关的不同形式^[5]。在分离血液时, 往往会造成部分DNA来源的缺失。当提取与细胞相关的真菌核酸时, 大量标本需要被离心获得纯的微粒用于提取; 如果大部分DNA是在循环物中, 需要在DNA提取前进行超滤纯化。有研究表明, 比较PCR检测曲霉、白假丝酵母菌时, 血浆和全血在诊断的敏感性上没有明显差异^{[9, 10]}。另外, 脑脊液标本被用来提高真菌性脑膜炎和脑炎的诊断, 但还没有理想的脑脊液核酸提取方法和步骤。还有研究尝试从组织中提取DNA 来检测真菌, 一方面需要新鲜的组织来源, 另一方面需要将组织完全消化以促进侵袭的真菌核酸释放出来, 尚缺乏大量验证^[11]。选择标本后对其处理和储存的过程中会有环境污染的问题, 因此临床被检测标本的选择和处理方式不仅要考虑其获取的难易度、目的基因的有效检出率, 而且更要关注预防或避免生物污染的可行性。

PCR反应体系包括引物、模板、酶、dNTP、离子等。引物选择必须满足特异和敏感的同时, 还应包括临床应用的简便性。目前, 有关真菌PCR选择的引物包括通用引物和特异性引物。真菌常用通用引物包括18S rRNA、内转录间隔区(ITS)、28S rRNA等。真菌核酸序列研究几乎都集中在rRNA基因上, 因为rDNA 存在着广泛的保守区域, 可以用作引物的结合位点, 同时客观存在的不同区域进化水平不同, 可以用于不同分类等级的研究。

1. 真菌PCR的引物选择 大量文献显示, 选择18S rDNA和28S rDNA序列是因为其中既有保守区又有可变区, 在进化速率上比较保守, 其中18S比28S基因更保守。但有人指出18S在烟曲霉菌种内有拷贝数量的变异^[12]; 若选择5.8S基因区域, 因相对分子质量小且呈高度保守, 多半被选择为真菌rDNA PCR扩增的通用引物。ITS序列的长度比较适中, 但因ITS不加入成熟核糖体, 所受的选择压力较小, 进化速率较快, 表现出了极为广泛的序列多态性。适用于通用引物探针检测的菌种较多, 但由于定植菌及环境中的污染菌的污染, 导致假阳性概率也会相伴升高。若选择特异性引物, 因其太局限伴随产生的假阴性也会令人烦恼。此外, PCR反应体系中, 根据添加模板DNA的量不等或标本来源各异, 加上前期核酸提取后存在浓度的差异, 均会直接影响其检测的结果^[12]。建议通过大量实践数据的积累与分析, 从而找到统一的可供参考的PCR体系标准, 可实现PCR的临床推广。

2. PCR反应过程中的污染问题 PCR反应的全过程中, 保障检测的质量安全之一是控制其中可能导致的污染环节。所以检测过程中的污染是一块巨大的拦路石, 我们必须面对, 况且目前谈论的是关于真菌的PCR。已知真菌的孢子可呈气溶胶方式存在于自然环境中, 他们对试剂和标本的污染会导致其检测结果产生假阳性^[9]。为此Mengoli等^[9]强调, 为有效避免标本DNA 提取过程的交叉污染, 实施PCR检测真菌基因的实验室必须健全防范措施, 其中包括在PCR操作前或后采用多方向的工作流模式; PCR分析前后实验操作要在不同的实验室进行(物理隔离); 使用防气溶胶的枪头和层流净化罩, 以及在PCR反应混合体系中, 应当使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和脱氧尿嘧啶(dUTP)代替三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP), 最终消除体系中存在的污染物等重要的建议。

3. 防范标本中人源性DNA的污染 与其他病原体基因分析所用PCR不同的是, 来自标本中的人类DNA分子成为其主要抑制物^[5]。根据已经报道的相关资料表明, 人类DNA能够影响其检测结果的原因是:首先人类DNA分子与其引物形成了非特异性产物; 其次是通过人类DNA分子来抑制目的基因— — 真菌DNA的扩增子, 结果趋势表现为假阴性(直接影响其检测的敏感性)。于是Khot等^[5]建议, 可以采用单独分离人类DNA的PCR或其他方法来评估人DNA对真菌检测造成影响的最低浓度。同时, 实验中在每个PCR反应管中需设立内扩增质控(internal amplification control, IAC), 监测结果的可靠性。

4. PCR扩增方式的选择原则 目前可选择的PCR扩增方式琳琅满目。其实选择不同的PCR扩增方式, 不仅决定了PCR检测的敏感性和特异性, 而且还涉及临床实验室的可行性。如巢式PCR通过2轮PCR反应, 使用2套引物扩增特异性的DNA片段, 第2对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段, 其足以提高其检测的特异性, 也能克服来自人类DNA的抑制作用。但是, 2次PCR反应难以避免污染问题, 包括环境对标本的污染和标本产生的气溶胶对环境的污染以及标本间污染。多重PCR是将多引物以各种方式混合在同一反应中, 同时扩增多个基因, 大大减少了可能导致污染的诸多环节, 是理想化的方式之一。终因混合体系中各种靶DNA的量间差异或反应条件存在不协调性, 容易导致扩增子的竞争反应而产生假阴性的结果^[13]。目前, 广泛被看好的荧光实时定量PCR, 在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能。荧光实时定量PCR具有敏感性高、取样少、快速、简便等优点, 尤其在真菌核酸检测中可以减少操作中的污染问题, 得到较为标准化的核酸产物, 同时可以监测抗真菌药物的疗效。Khot等^[14]报道了应用荧光实时定量PCR检测浓缩的BAL中真菌DNA分子, 结果在临床侵袭性肺部曲霉感染确诊和拟诊病例中曲霉DNA分子的检出率高达76.9%, 当再结合临床资料作多因素分析后, 认为还是存在不符合的情况, 提示现用的荧光实时定量PCR直接用于BAL中真菌DNA分子的检测尚存在假阳性, 而导致其假阳性的原因不仅仅是荧光实时定量PCR本身, 可能还涉及标本选择的问题。

每一种方法的建立与推广应用必须通过其方法学的客观评价。针对其方法学的客观评价必然会涉及到统计学的分析。统计学分析中常用的性能评价参数为:敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值, 他们的公式分别为:敏感性=真阳性/真阳性+假阴性、特异性=真阴性/真阴性+假阳性、阳性预测值=真阳性/真阳性+假阳性、阴性预测值=真阴性/真阴性+假阴性。目前对于真菌核酸诊断应用的研究和价值评估, 除了应采用合理的规范有序的统计学分析外, 一定程度上还必须结合临床资料综合分析予以产生真正有价值的参考信息, 由此而得出更为可靠的标准操作程序。

一般而言, 一个完美的PCR体系能提供较高的检测敏感性和特异性。高敏感性可以排除病原体的感染; 高特异性可以确定感染相关病原体的存在和种系。就目前而言, 从临床标本的选择和处理到PCR检测后的分析等诸多环节都存在着各种各样的影响因素。为此, 欧洲曲霉PCR行动委员会(European Aspergillus PCR Initiative, EAPCRRI)已经致力于曲霉PCR标准化方案的实施探讨。据悉, 我国也有许多相关学者在积极致力于以PCR为基础的有关真菌分子诊断方面的研究工作。所以, 不仅是研究工作者, 还应当包括在实验室中应用PCR对临床IFD进行监测的操作人员, 以及临床的医师都需要获悉上述提及的诸多问题。

路漫漫, 任重而道远。我们深信, 随着国内外有志者们的努力探索, 该方法的问世指日可待。我们期待着“ 真菌核酸检测” 时代的到来, 期待着他能真正的为临床疾病的早期诊断和治疗监测做出贡献。