miRNA作为非编码单链小RNA分子, 通常在转录后水平调控基因表达。细胞核内编码 miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ 作用下转录生成含数百到数千个碱基对的原始miRNA (pri-miRNA)。pri-miRNA在由核酸内切酶 RNase Ⅲ 家族成员 Drosha 及属于双链RNA结合蛋白(dsRBD) 的DGCR8组成的复合物作用下, 在核内加工成大小6070 nt 、具有发夹结构的单链miRNA前体(pre-miRNA) 。pre-miRNA在 Ran-三磷酸鸟苷(GTP)依赖的核质/ 胞质转运蛋白Expoain 5的作用下转移至胞质, 并被RNA诱导的基因沉默复合物(RISC ) 识别^[6], 另外通过Dicer酶将其剪切形成 22 bp不完全互补的双链, 双链解开后 , 其中1条成熟的miRNA链与 Ago2结合留在活化的RISC中^[7]。miRNA再通过互补序列识别靶 mRNA 并与其 3'UTRs结合, 由Ago2剪切靶mRNA使其降解或抑制mRNA翻译 , 诱导转录后基因沉默^[8]。

近年来不断建立了多种对miRNA高通量检测的技术, 如miRNA芯片、定量聚合酶链反应(PCR)、基于荧光微球的流式细胞miRNA表达谱分析技术等。应用这些技术现已证实不同肿瘤组织中miRNA的表达谱具有很大差异, 然而这种差异表达与肿瘤发生和发展间的关系尚未阐明。但已有令人信服的证据表明某些miRNA直接参与了肿瘤的形成。这些miRNA具有类似致癌基因的功能, 称为“ onco-miRNA” 。 研究较为深入的致癌miRNA有miR-155, 其在多种类型的B细胞恶性肿瘤中高表达。Costinean等^[9]建立了一种B细胞高表达miR-155的转基因小鼠, 该鼠表现出前B细胞增殖明显等白血病前期现象, 继而出现恶性B细胞淋巴瘤。这一结果证实了miR-155直接参与了这些肿瘤的发生和发展。相对于致癌miRNA, 有些miRNA具有抑癌作用。CLL患者中50%以上miR-15a 和miR-16-1低表达或缺失^[4]。随后的研究发现, miR-15a 和miR-16-1可下调抗凋亡基因Bcl2的表达。

2005年Lu等^[10]分析了20种人类肿瘤miRNA表达的变化, 发现每一种肿瘤都有一种特征性的miRNA表达谱, 大多数低分化肿瘤可根据其miRNA的表达水平确定起源的组织或器官。很多研究还发现约50%miRNA位于脆性位点或易发生染色体断裂或扩增及融合的位点^[11]。这些结果均证实在肿瘤发生和发展过程中miRNA表达谱的改变和鉴定有利于提高肿瘤的诊断和预后判断, 也为基因治疗提供了新靶点。

目前, 绝大多数关于miRNA与肿瘤关系的研究都建立在肿瘤组织上, 由于分析标本困难且程序繁琐, 属有创性, 不利于临床开展。血清的获取简便, 对血清中miRNA进行检测以诊断肿瘤及判断预后更适于临床的应用。正如Lena和Frank所说, 虽然肿瘤特异性的miRNA对于揭示肿瘤的分子生物学基础非常重要, 如能在血液中检出肿瘤特异性的miRNA, 并将其作为生物学标志对于早期诊断肿瘤则具有至关重要的意义^[12]。

1. 游离miRNA的来源 目前对于游离miRNA的来源主要观点有:(1)游离RNA来源于凋亡或坏死的细胞; (2)细胞的主动释放; (3)循环中细胞的裂解。但对于特定游离miRNA的真实来源还存在许多未知的因素^[13]。

Chen等^[14]发现血清中的小RNA中有丰富的miRNA 片段。血清和血细胞都含有混合的小RNA 族 (长度< 30 nt) , 包括miRNA、rRNA 片段以及mRNA片段。对健康人血清、非小细胞肺癌和肠癌患者血清中的小RNA分子进行测序分析。与对照血清相比, 肺癌患者血清miRNA谱明显不同, 28 种正常血清中存在的miRNA没有检出, 但是检测出 63 种在正常血清中没有的miRNA分子, 同样在肠癌患者血清中检测出 69 种正常血清中没有的miRNA。肺癌患者血清miRNA谱与血细胞miRNA谱也存在明显的差异, 有 57 种miRNA在肺癌患者血清和血细胞中共有, 但有 76 种miRNA仅在血清中检出。这一点与健康人也不同, 健康人血清和血细胞中miRNA谱基本相同。研究结果还显示, 包括肿瘤在内的疾病患者血清中miRNA不仅来自于循环血细胞, 也来自于受疾病发展影响的其他组织, 这些与疾病相关的血清miRNA可作为潜在的标志物。

Mitchell等^[15]更直接地验证了血清中是否存在源自肿瘤的游离miRNA分子。将人前列腺癌细胞22Rv1接种到非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内, 在接种癌细胞的小鼠血浆中检测到了源自人肿瘤细胞, 而在小鼠中没有同源基因的miR-629* 和miR-660, 并且miR-629* 和miR-660 丰度与移植瘤小鼠肿瘤的大小有一定的相关性。这一实验结果表明源自肿瘤的miRNA能够进入血液循环, 并且这种游离miRNA的量一定程度可以反映肿瘤的大小。

2. 游离miRNA的生物学特征 (1)稳定性:众所周知, RNA分子受到RNaseA作用易于降解。令人惊讶的是miRNA、特别是血清miRNA, 却非常的稳定, 表现在对RNaseA 分解作用及其他恶劣环境具有抵抗力。Chen等^[14]进行研究也证实, 血清中miRNA是稳定的, 能在血清中直接检测。因此, 在血清中测得的miRNA水平与从患者体内得到的数据吻合度很好, 从而具有临床检测的价值。miRNA对RNaseA降解抵抗的机制目前尚不清楚, 有待进一步的研究。但有研究表明, 内源性循环miRNA分子多数不是以游离形式存在的, 常与蛋白质等形成颗粒^[13]。因而内源性的循环RNA分子具有良好的抗RNaseA降解能力, 有较高的稳定性; (2)特异性:由于肿瘤miRNA表达谱的组织特异性, 血清中存在的miRNA是源自肿瘤组织中miRNA。因此, 毫无疑问每种肿瘤类型都有独自的血清miRNA表达谱。Chen等^[14]证实发现肺癌患者血清中有63 种在正常人血清中没有的miRNA分子, 同样在肠癌患者血清中检测出了 69 个正常人血清中没有的miRNA。虽然一些miRNA(如 miR-134、miR-146a、 miR-221、miR-222、miR-23a)在肺癌和结肠癌患者的血清中均存在, 但肺癌和结肠癌都有各自特异的血清miRNA表达谱。

目前我们应用了几十年的血清肿瘤标志物, 例如甲胎蛋白(AFP)诊断原发性肝癌, 糖抗原(CA)199对胰腺癌的诊断等, 均没有足够的敏感性、特异性和准确性, 这也是单个肿瘤标志物在临床应用中的缺陷。 相反, 多个生物标志物对某个疾病诊断, 在诊断性能上将会显示出优越性。

近来的研究明确表明, 血清中含有来自于各种组织器官的游离miRNA , 这些血清miRNA表达谱可以作为疾病诊断新的血清标志物, 并且其可能比目前所应用的肿瘤和其他疾病的早期诊断方法更为敏感及特异。下面将对游离miRNA对肿瘤诊断的研究进展作一总结。

1.淋巴瘤 Lawrie等^[16]比较了弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者和正常人血清中与肿瘤相关的MIRN155 (miR-155)、MIRN210 (miR-210) 和MIRN21 (miR-21)水平, 发现患者血清中的这些miRNA水平较正常人高, 而且高MIRN21表达水平被认为与无复发存活率有关。提出miRNA可作为区分DLBCL和其他肿瘤新的非侵入性诊断标志物。

2.结肠直肠癌(CRC) 目前, 所有用于CRC筛查的实验都具有明显的缺陷, 还未有一种被医疗系统及大众广泛接受, 显然临床迫切需要新的早期诊断CRC的方法。Gilad等^[17]采用逆转录定量PCR(qRT-PCR)对CRC患者和健康人血清中miRNA进行检测及评估, 发现健康人血清中miRNA水平较为一致; 与其相比, CRC患者血清中有11种miRNA具有明显变化。其中hsa-miR-16 及hsa-miR-125b较健康人偏低, 联合这2种miRNA诊断CRC, 敏感性高达91%、特异性达72%, 受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)达0.86。这一数据表明, miRNA与目前使用CRC筛查实验的性能比较, 具有一定的优势。因此, 游离miRNA可以作为血清肿瘤标志物, 是 CRC筛查实验的新选择。另外, 对于28例早期CRC转移患者, 有4种miRNA与正常人比较差异有统计学意义。Chen等^[14]在比较了CRC患者和正常人血清miRNA, 检测出了 69 个正常血清中没有的miRNA, 其中14种 miRNA包括miR-485-5p、miR-361-3p、 miR-326和miR-487b等具有CRC特异性。

3.肺癌 文献报道肺癌患者血清中存在8种肺癌特异性的miRNA, 包括miR-205、miR-206和miR-335等, 同时证明了血清中水平明显升高的2种与肿瘤形成相关的miRNA--miR-25和miR-223 是非小细胞肺癌的血清标志物^[14]。

利用Solexa方法, 发现CRC患者与肺癌患者共有一大批血清miRNA(如 miR-134、miR-146a、miR-221、miR-222和miR-23a等)。Pearson相关系数散点图进一步揭示CRC患者与肺癌患者的血清miRNA水平一致。这意味着血清中存在着共同的肿瘤相关miRNA, 可能与肿瘤形成及细胞分化/成长有关。这预示着这些共同miRNA可用于肿瘤的大范围筛查^[14]。

4.卵巢癌 大约67%的卵巢癌患者确诊时已属晚期, 因此在早期诊断上取得突破可明显提高生存率^[18]。

由于活动性肿瘤细胞可释放外来体(exosome)进入外周血循环, 且血液标本的获取较肿瘤组织标本更简单、无创。Taylor等^[19]课题组采用抗上皮细胞黏附分子(EPCAM)磁珠分选技术, 从卵巢癌患者血清中分离肿瘤外来体。将肿瘤外来体与相应患者肿瘤细胞的miRNA表达谱进行比较, 观察了先前认为具有诊断价值的8种miRNA水平(miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200c、miR-200b、miR-203、miR-205和miR-214)。结果表明这8种miRNA在肿瘤细胞和血清中外来体的表达水平是相近的(相关系数0.710.90), 认为循环中肿瘤的外来体可以替代组织活检而成为诊断标志物^[19]。

Resnick等^[20]研究比较了28例病理学确诊的卵巢上皮癌患者治疗前和15名正常人的血清中miRNA表达谱, 发现有21种miRNA呈现明显差异。与正常人相比, 肿瘤患者的血清miR-21、miR-92、miR-93、miR-126和miR-29a明显过度表达; 然而miR-155、 miR-127和miR-99b 表达明显降低。另外, 3例手术前具有正常CA125浓度的患者中, miR-21, miR-92和miR-93表达增高。Resnick认为从血清中提取RNA作为检测miRNA诊断卵巢癌是简便的。miR-21、miR-92 和miR-93 作为致癌因子, 是潜在的疗效评估等生物标记物。

5.前列腺癌 为了证明外周血存在肿瘤来源的miRNA, Mitchell等^[15]将人前列腺癌细胞株22RV1接种于NOD/SCID小鼠。28 d后收集小鼠血浆, 采用qRT-PCR检测miRNA, 发现22RV1特异的miRNA— — miR-629* 和miR-660仅出现在肿瘤细胞接种鼠血浆中, 而对照鼠未检测到。继而, 他们检测了25例转移性前列腺癌和25例年龄匹配的健康男性血浆中6种miRNA(miR-100、miR-125b、miR-141、miR-143、miR-205和miR-296), 发现除miR-205外有5种miRNA在肿瘤患者血清均高表达。miR-141高表达极为显著, 2组血浆间的差距达到46倍。进一步分析发现miR-141检测前列腺癌的敏感性为60%, 特异性为100%, AUC为0.907。将miR-141水平与前列腺特异性抗原(PSA)值进行相关分析, Pearson 和Spearman相关系数为0.85。miR-141是一种表达于上皮细胞癌的miRNA, 包括乳腺癌、肺癌、CRC和前列腺癌, 因此有可能作为这些肿瘤的血浆生物标记物。

由于血清中的 miRNA 分子有良好的稳定性, 同时采用常规 RNA 提取方法就可以获得满足实验要求的miRNA。对于血清中miRNA分子的检测, 实时定量PCR为我们提供了最适用和有效的方法^[21], 这些便利条件都为临床大规模检测奠定了基础。随着检测技术的成熟, 准确地对miRNA进行测定将变得更容易、快捷, 也更便宜。有研究发现, miRNA除了存在于血清中, 也存在于其他体液中, 包括尿液、泪液、精液和羊水^[14]。显然, 体液miRNA 获取的便利和稳定性将拓宽其在实验研究和临床中的应用。