引用本文
陈志晓, 王前, 郑磊, 包杰, 曾方银. 改良缺血修饰白蛋白测定方法(白蛋白-钴结合试验)的建立. 25(5): 372-375
CHEN Zhixiao, WANG Qian, ZHENG Lei, BAO Jie, ZENG Fangyin. Establishment of improved albumin cobalt binding assay to detect ischemia modified albumin. Labratory Medicine, 25(5): 372-375  
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改良缺血修饰白蛋白测定方法(白蛋白-钴结合试验)的建立
陈志晓, 王前, 郑磊, 包杰, 曾方银
南方医科大学南方医院检验科,广东 广州 510515

作者简介：陈志晓,男,1976年生,学士,主管技师,主要从事生物化学与分子生物学研究。

通讯作者：王前,联系电话：020-61642147。

基金:广东省科技计划项目（2006B1290121）
摘要
目的

建立改良的缺血修饰白蛋白(IMA)测定方法[白蛋白-钴结合(ACB)试验]。

方法

以1-亚硝基-2-萘酚(NN)代替二硫苏糖醇(DTT)作为显色剂,确定试验的基本条件(最佳波长、反应时间、试剂稳定性等),并对该试验的精密度、敏感性、线性等进行评价。测定急性心肌梗死(AMI)和胸痛患者的IMA值并进行统计学分析。

结果

改良ACB试验最佳吸收波长为410 nm,反应体系025 min时吸光度值变化稳定,试剂在室温和4 ℃ 30 d内性能稳定,反应体系线性良好。批内变异系数( CV)为2.67%,批间 CV为5.44%。应用显色剂NN对钴离子(Co2+)的最低检出限为0.488 mg/L,应用DTT为7.812 mg/L。三酰甘油(TG)<2.02 mmol/L、血红蛋白(Hb)<6.9 g/L、总胆红素(TBil)<66.0 μmol/L时无干扰。AMI组为(1.195±0.320)吸光度单位(ABSU),胸痛组为(0.855±0.068)ABSU,二者差异有统计学意义( P<0.01)。

结论

以NN作为显色剂测定IMA的ACB试验灵敏、方便、简单,适合批量测定。

关键词: 缺血修饰白蛋白; 白蛋白-钴结合试验; 急性心肌梗死; 1-亚硝基-2-萘酚; 二硫苏糖醇
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)05-0372-04
Establishment of improved albumin cobalt binding assay to detect ischemia modified albumin
CHEN Zhixiao, WANG Qian, ZHENG Lei, BAO Jie, ZENG Fangyin
Department of Clinical Laboratory, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China
Abstract
Objective

To establish an improved albumin cobalt binding (ACB) assay for detecting ischemia modified albumin (IMA).

Methods

1-nitroso-2-naphthol(NN) as a new chromogenic reagent was used to replace dithiothreitol (DTT), and the basic conditions of the assay were ascertained, including the best absorption wavelength, the best reaction time and the stability of reagent and so on. The precision, sensitivity and linearity of the ACB assay were evaluated. The IMA values of acute myocardial infarction (AMI) group and chest pain group were measured and analyzed statistically.

Results

The improved method's best absorption wavelength was 410 nm; its value of absorption changed stably in 0-25 min; the reagent was stable both in room temperature and 4 ℃ within 30 d; the linearity of the method was excellent. The coefficient of variation ( CV) of within-run assay was 2.67%, and the CV of between-run assay was 5.44%. The detection limit was 0.488 mg/L when using NN, while it was 7.812 mg/L when using DTT. There was no interference at triglyceride (TG)<2.02 mmol/L,hemoglobin (Hb) <6.9 g/L,total bilirubin (TBil) <66.0 μmol/L. The concentration of IMA in AMI group [(1.195±0.320)absorbance units (ABSU)] was obviously higher than that in chest pain group[(0.855±0.068)ABSU] ( P<0.01).

Conclusions

ACB method in which NN is used as a new chromogenic reagent to detect IMA is sensitive, simple, convenient and suitable for batch detection.

Keyword: Ischemia modified albumin; Albumin cobalt binding assay; Acute myocardial infarction; 1-nitroso-2-naphthol; Dithiothreitol

缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin, IMA)是近年来发现的一种新的生化标志物, 在早期诊断急性心肌梗死(AMI)中具有独特的优势。在心肌缺血5~10 min内IMA即可升高, 可持续6 h, 其诊断心肌缺血的敏感性优于目前所有的标志物和其他检查[1]。IMA的测定通常是采用白蛋白-钴结合(albumin cobalt binding, ACB)试验, 鉴于白蛋白(Alb)N末端氨基酸序列能与钴离子(Co2+)结合, 而经修饰的Alb即IMA不与Co2+结合, 再加入显色剂二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT), 间接测定游离Co2+浓度, 故血清中游离Co2+的浓度越高, 样本中的IMA含量就越高。由于显色剂DTT的熔点低(42~43 ℃), 在37 ℃、0.67 Pa时升华, 易被空气氧化, 稳定性差, 气味难闻, 可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。因此, 寻求一种稳定的显色剂替代DTT进行IMA的检测就非常必要。而显色剂1-亚硝基-2-萘酚(1-nitroso-2-naphthol, NN)的熔点高(109~110 ℃)、价格低廉、保存方便、毒性较低。为此我们探讨了NN在测定IMA上的应用。

材料和方法
一、研究对象

2008年5月至2008年12月, 阳江市人民医院心血管内科和重症监护病房收治确诊为AMI及胸痛的患者, 按世界卫生组织诊断标准作出诊断。其中AMI组43例, 胸痛组41例, 所有患者均在胸痛发生后6 h内抽血, 采用盲法诊断和测定。排除标准:除AMI以外的心脏疾病、妊娠、胃肠道缺血综合征、血管性病变等影响到IMA测定的疾病。所有病例均无合并心力衰竭、房颤等其他心脏疾病。

二、仪器与试剂

HITACHI 7180全自动生化分析仪(日本日立公司); 722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。CoCl2· 6H2O、NN、DTT 均为成都科龙化工试剂厂产品; 胆红素校准品(218.9 μ mol/L)(日本和光); 脂肪乳注射液(安徽丰源药业有限公司); 血红蛋白(Hb), 收集红细胞冷冻制成。试剂1(R1)为0.1 g/L的CoCl2· 6H2O溶液, 试剂2(R2)为0.1 g/L的NN溶液, DTT配制成浓度为1.5 g/L[2]的溶液。R1、R2的浓度根据最佳显色比例确定, 结果以吸光度单位(absorbance units, ABSU)表示。

三、方法

1.最佳吸收波长 取0.2 mL混合血清样本, 加入3 mL R1, 37 ℃孵育5 min。再加入0.8 mL R2, 孵育5 min。分别于340~800 nm , 每隔10 nm用722分光光度计测其吸光度值, 作吸光度曲线, 取吸光度波峰点作为最佳吸收波长。

2.反应体系的稳定性 样本加R1、R2后分别于即刻、5、10、12、15、20、25、30 min时测定其吸光度值, 作稳定性曲线。

3.试剂稳定性 稳定性测定为先在最短时间内连续测定混合样本20次, 计算出均值( x-)和标准差(s), 再将试剂分别放置于室温和4 ℃, 然后每天连续测定同一混合血清样本, 再计算其差异, 根据质控规则判断是否失效。

4.Co2+敏感性对比试验 先用2.0 g/L CoCl2溶液作15次倍比稀释, 分成2组, 每组15支试管, 每组按稀释顺序加3 mL CoCl2溶液作为R1, 再分别加入0.2 mL混合血清样本水浴5 min, 然后第1组加入1.5 g/L DTT溶液 1.0 mL, 测定波长为570 nm; 第2组加入0.1 g/L NN溶液1.0 mL, 水浴5 min后测定其吸光度值, 测定波长为405 nm。

5.精密度试验 批内和批间重复性试验分别选取1个混合血清样本连续测定20次和连续测定20 d, 分别计算出 x-、s和变异系数(CV)。

6.干扰试验 根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)评价方案, 采用“ 配对差异” 的试验方法。一份加干扰物[三酰甘油(TG)、总胆红素(TBil)、Hb], 另一份不加, 以对照该组浓度 x-± 1.96s判断有无干扰。

7.线性评价 设5个不同浓度的样本。选择高值和低值样本各1个, 高值样本为1号, 低值样本为5号, 二者3∶ 1混匀为2号, 等份混匀为3号, 1∶ 3混匀为4号, 再拟合曲线。

8.对比试验 选取30个患者, 分别用NN和DTT作为显色剂测定IMA, 计算出 x-和s, 比较2种显色剂的效果。

9.病例组IMA测定 分别测定胸痛组和AMI组的IMA值, 并进行统计学分析。

四、统计学方法

使用SPSS 11.5统计软件进行分析, 结果以 x-± s表示, 线性评价回归方程用线性回归分析, 病例组及对照组的比较用独立样本t检验。

结 果
一、最佳波长

最佳吸收波长在410 nm左右, 波峰值为0.982 ABSU。由于HITACHI 7180全自动生化分析仪在410 nm波长附近只有405 nm, 所以选取测定波长为405 nm。

二、反应体系的稳定性

反应体系随时间变化反应稳定, 加入显色剂后025 min时吸光度值变化稳定。本研究选取Alb-Co2+结合时间为5 min, 显色时间为5 min, 见图1。

图1 显色最佳时间及稳定性曲线图

三、试剂稳定性

先在最短时间内连续测定混合样本20次, 结果为(0.670± 0.036) ABSU。30 d内, 试剂在室温和4 ℃都没有超出范围, 性能稳定。

四、Co2+敏感性对比试验

通过试验观察, 用NN作显色剂明显比DTT敏感, NN作显色剂能检测到0.488 mg/L CoCl2; 而以DTT作显色剂, 在CoCl2为7.813 mg/L时才会有明显的吸光度变化, 二者比较差异有统计学意义(P< 0.05)。

五、重复性试验

改良ACB试验的批内CV为2.67%, 批间CV为5.44%

六、干扰试验

混合血清IMA测定值为(0.908± 0.049)ABSU、TG为0.59 mmol/L、Hb为1.2 g/L、TBil为12.6 μ mol/L。加入干扰物, TG< 2.02 mmol/L、Hb< 6.9 g/L、TBil< 66.0 μ mol/L时无干扰。

七、线性评价

线性评价设的5个不同浓度的样本通过计算和测定吸光度, 并进行曲线估计得到方程Y=1.71-2.16X, 线性良好, 见图2。

图2 曲线估计图注:Y=1.71-2.16X

八、对比试验

用0.1 g/L NN作为显色剂的吸光度值为(1.085± 0.384)ABSU, 用1.5 g/L DTT作为显色剂的吸光值为(0.990± 0.179)ABSU, 二者差异无统计学意义(P> 0.05)。

九、IMA的测定

AMI组IMA测定值为(1.195± 0.320)ABSU, 胸痛组IMA测定值为(0.855± 0.068)ABSU, 二者差异有统计学意义(P< 0.01)。

讨 论

1994年美国食品及药物管理局(FDA)批准的IMA为第1个评价心肌缺血的指标, 其与传统的心肌坏死指标不同, 在心肌缺血发作后5~10 min血中浓度即可升高[1], 缺血停止后仍能持续数小时。Bar-Or等[3]对41例接受选择性经皮球囊冠状动脉形成术(PTCA)患者的研究发现, Alb结合能力的下降在PTCA诱导的缺血性改变后数分钟内即可出现, 并可通过ACB试验检测到测定值的升高, PTCA后6 h内回复至基线水平。显色剂DTT是强还原剂, 散发的气味难闻, 可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。熔点较低(42~43 ℃), 沸点为125~130 ℃(0.27 kPa), 在37 ℃、0.67 Pa时升华, 易被氧化。因此DTT的稳定性较差。

本研究测得的最佳吸收波长为410 nm, 此时的吸光度值最高, 与传统ACB试验测定的最佳吸收波长470~500 nm不同[4]。与传统ACB法相比, 改良ACB法测定Co2+具有更高的敏感性。本研究发现, 用NN作显色剂明显比DTT敏感。本研究的改良ACB试验显色最佳时间非常短, 在加入显色剂后立即显色, 并马上达到峰值, 而且显色体系很稳定[5], 非常有利于临床试验室开展快速检测。所以NN在稳定性、敏感性方面都优于DTT, 而且毒性更小, 成本更低廉, 更加适合ACB试验。

混合血清样本测定结果显示, 批内CV为2.67%、批间CV为5.44%, 试验的重复性较好。与传统ACB试验的批内和批间CV(2.2%~7.3%)基本一致[6, 7]。

针对临床上易出现溶血、脂血和黄疸的样本, 本研究进行了干扰试验, 当TG< 2.02 mmol/L、Hb< 6.9 g/L、TBil< 66.0 μ mol/L时, 3种干扰物对改良ACB试验无影响, 与贾克刚等[8]传统ACB法的研究结果一致。所以, 临床上遇到溶血和脂血样本时建议重新抽血测定。

改良ACB试验线性良好、试剂性能稳定, 分别用不同浓度的NN和DTT溶液作为显色剂测定IMA, 发现2种显色剂差异没有统计学意义, NN作为显色剂能够代替DTT。通过入选病例观察, 发现AMI组IMA测定值明显高于胸痛组(P< 0.01)。

总之, 以NN代替DTT的改良ACB试验各项指标均符合方法学评价要求。其试验条件的建立更为简便、检测快速, 敏感性高, 检测成本低廉, 是一个较简单而科学的试验方法, 适合普通临床试验室开展。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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