1. 血浆 (1)正常血浆:取自健康体检者, 空腹12 h以上, 清晨采静脉血。采用0.109 mol/L枸橼酸钠溶液按1∶ 9比例制成抗凝全血, 颠倒混合10次, 以2 500 r/min(离心半径15 cm)常温离心15 min, 除去血小板, 分离血浆, 室温保存, 在2 h内测定; (2)异常血浆:FIB增高和降低的血浆取自临床心脑血管疾病、血栓病、糖尿病、恶性肿瘤和术后抗凝治疗及弥散性血管内凝血(DIC)和重症肝炎患者, 部分FIB减低的标本是用生理盐水按不同比例稀释的正常血浆标本。

2. 仪器 法国STAGO STart-4半自动血凝仪、意大利MINIVOLT BICO双信道血凝仪、日本Sysmex CA-1500全自动凝血测定仪。

3. 试剂 太平洋(pacific)公司凝血酶(Thromin)试剂盒, 凝血酶每瓶100 IU, 用蒸馏水作为稀释液; 太平洋公司咪唑缓冲液(Imidazole Buffer); 标准品为美国Pacific公司产品, 定值5.98 g/L。

4. 测定原理 凝血酶是一种活力强大, 可作用于多种凝血因子的水解酶, 其首要功能是使FIB裂解生成FM和2个小肽碎片(A肽和B肽), A肽和B肽在FXⅢ 及Ca²⁺作用下可使一个分子的ε -赖氨酰基为供体, 以另一个单体分子γ -谷氨酰基为受体进行共价交联, 形成稳定纤维蛋白, 生成纤维蛋白所用时间与FIB含量呈反比, 通过光电子法测定杯内钢球振幅的改变来测定凝固时间。

5. 测定参数 (1)测定方法:取血浆30 μ L加入270 μ L 咪唑缓冲液于试管内, 充分混匀后取200 μ L加入测试杯内, 同时加入钢球一起预温3 min, 加入已预温凝血酶试剂100 μ L立即测定; (2)绘制标准曲线:FIB定值标准品配成8.97、5.98、2.99、1.79、1.49、0.75 g/L等不同浓度, 分别测定形成纤维蛋白所用的时间, 每个标准品测定3次, 求均值, 将FIB的浓度和对应的凝固时间输入仪器内, 仪器会自动绘制标准曲线, 并计算出线性关系。

1. 本法的线性 用FIB定值标准品配成0.75、1.49、1.79、2.99、5.98、8.97 g/L度, 进行测定形成纤维蛋白所用的时间, 用双对数坐标法绘制标准曲线结果见图1, 结果显示FIB在1.13~7.01 g/L内线性甚好。

图1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 FIB的标准曲线

2. 本法的精密度 结果见表1。

表1

表1

表1 不同FIB浓度血浆标本进行20次批内重复测定结果 标本 (g/L) s CV(%) 1 0.82 0.174 21.00 2 1.32 0.087 8.58 3 1.86 0.084 4.52 4 2.58 0.093 3.59 5 3.96 0.145 3.68 6 4.85 0.187 3.85 7 5.79 0.233 4.02

表1 不同FIB浓度血浆标本进行20次批内重复测定结果

以太平洋公司标准血清(高值为5.98 g/L、中值为2.99 g/L、低值为0.75 g/L)进行批间重复性测定, 每天上、下午双份测定, 共10 d, 所得批间CV高值为4.91%, 中值为3.62%, 低值为15.24%。

当FIB浓度较低时, 其精密度降低, 而且其结果也偏低。为此, 我们又采用clauss法对1号标本和低值标准血清进行了重复测定, 其CV值分别为8.25%和9.39%。

血浆中FIB生理浓度为2.0~4.0 g/L, 该浓度具有生理和病理双重作用。一方面保证在凝血最后一步, 有足量的FIB聚合成不可溶性纤维蛋白, 另一方面又影响了血浆和血液粘滞度。FIB浓度受外伤、炎症、妊娠、肥胖、吸烟等影响, 也受遗传因素影响, 并随着年龄的增长呈进行性增高。血浆FIB测定是凝血功能检查的基本项目之一^[1]。血浆中FIB浓度的测定对出血性疾病、心脑血管病、糖尿病、肿瘤等疾病的诊断、治疗和预防有重要的意义。同时, FIB又是术前检查的一项重要指标, 也是溶栓降纤治疗时必须监测的一项重要指标。FIB测定的准确性对临床十分重要, 所以, 为临床提供准确的数据, 尤其是低值标本时, 可使患者在溶栓的最佳时间得到最安全的治疗。

文献中查到和临床实验室使用过的FIB检测方法达数十种, 不同的方法有其各自的优缺点。目前, 以凝固法为原理的血凝仪应用较为广泛^[2], 其中clauss法是基于高浓度凝血酶加入血浆, 使之凝固所需时间与FIB浓度成反比之原理, 是测定有凝血功能的FIB, 特异性较高。多种因素(如抗凝比例、离心时间、血小板等)均能影响血凝分析仪测定结果^[3]。排除以上影响因素, 许多异常外观的血浆标本(溶血、黄疸和高脂血)对比浊法判定血液凝固终点存在影响, 干扰测定结果^[4]。磁珠法以电磁感应为原理, 通过检测血浆凝固过程粘度变化导致钢珠振幅的变化来确定凝固终点, 避免了血浆和试剂等因素的干扰, 是凝固法中较先进的检测方法。邓予晖^[5]通过实验证实采用磁珠法的血凝仪对血清胆红素、血红蛋白及乳脂蛋白等都有较好的抗干扰能力。但FIB的异质性、纤维蛋白(原)降解产物(FDPs), 以及存在肝素等抗凝物时均影响测定结果。

在本研究中观察到磁珠法测定FIB时, 如果其浓度较低, 则精密度和准确性都明显降低, 这与文献报道明显不符。后采用clauss法对低值标本和标准血清进行重复测定。为了具有可比性, 也采用光散射比浊法半自动凝血仪由同一组操作人虽进行测定, 其CV值明显降低。经仔细观察发现, 磁珠法测定低值标本时, 虽然纤维蛋白已经出现, 但不足以使磁珠停止运动, 迟迟不能到达凝固终点。磁珠法的最佳测定范围在8~25 s之间。FIB在正常范围时, 稀释倍数为1∶ 10; FIB在异常范围时, 可适当增加或减少稀释倍数, 使凝固时间落在8~25 s之间; 若FIB含量过高, 凝固时间少于8 s, 则按1∶ 20或1∶ 30稀释血浆, 重新测定, 结果乘以2或3; 若FIB浓度过低, 凝固时间大于25 s, 则按1∶ 5或1∶ 2稀释血浆, 结果除以2或5。

磁珠法比较简单, 易于掌握, 但也应该注意以下事项:(1)血浆必须是乏血小板血浆, 否则, 血小板中的凝血因子将影响测定; (2)用缓冲液稀释血浆时要准确。FIB在正常范围时, 稀释倍数为1∶ 10; FIB在异常范围时, 可适当增加或减少稀释倍数, 使凝固时间落在8~25 s之间; (3)试剂必须现用现配, 否则凝血酶活性不足或消失时, 凝固时间将延长; (4)各个实验室要建立自己的标准曲线, 并定时检查, 当条件改变时, 应重新建立。