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赵海燕, 王响, 武丽芬, 赵江花, 申特立. 糖化血清蛋白试剂盒抗干扰能力的改进. 25(3): 247-248
  
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糖化血清蛋白试剂盒抗干扰能力的改进
赵海燕1, 王响1, 武丽芬1, 赵江花2, 申特立1
1.峰峰集团邯郸医院检验科,河北 邯郸 056002
2.邯郸市中心医院,河北 邯郸 056002

作者简介：赵海燕,女,1973年生,学士,主管技师,主要从事临床生物化学检验工作。

关键词: 糖化血清蛋白; 干扰; 糖尿病
中图分类号:R446.1 文献标志码:B 文章编号:1673-8640(2010)03-0247-02

糖尿病(diabetes mellitus, DM)实验室检验方法包括尿液检查和血液生化检查。糖化血清蛋白(glucosylated serum proteins, GSP)半衰期短(17~19 d), 可反映机体2~3周内血糖的平均水平[1], 且GSP测定不受患者临时血糖浓度波动的影响, 因此被广泛用于DM患者血糖浓度的近期监控和疗效评价。GSP的测定方法有高效液相色谱(HPLC)法、层析法和化学法, 其中HPLC法是GSP测定的参考方法[2]; 化学法有硝基四氮唑盐(NBT)还原法和酶法, 均适用于自动化分析。目前国内多采用NBT还原法测定GSP浓度。NBT还原法测定GSP时血清中其他非特异性还原物质对测定存在干扰。我们所特指的干扰是仅指由维生素C(Vit C)、脂血、溶血及黄疸引起的干扰。为减少上述物质对测定的影响, 我们是在原GSP试剂中加入了能消除脂血、胆红素等对测定产生影响的化学试剂, 从而使其抗干扰性能较原试剂有显著改善。从而避免因为样本原因引起的测定偏差。

一、材料和方法

1.仪器及材料 (1)测定系统:Olympus AU 640全自动生化分析仪, GSP试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司); (2)干扰物质:Vit C(L-Ascorbic acid)购于北京化学试剂公司, 游离胆红素(free bilirubin, FBil)、Mixed Isomers(B4126-1G)和血红蛋白(Hb)(Hemoglobin human H7379-5G)购于Sigma公司, 脂肪乳糜(Intralipid 20%)购于 Fresenius kabi公司, 结合胆红素(conjugate bilirubin, CBil B850)购于Frontier公司; (3)表面活性剂ON-50:合成脂肪醇聚氧乙烯(3, 5, 7)醚(Lutensoi ON30、ON50、ON70)购于BASF公司。

2.血清样本采集及预处理 血清样本来源于峰峰集团邯郸医院临床混合血清[乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒4项阴性]。将混合血清分装后, 于-20 ℃冻存。使用时先常温下融化, 1 000 r/min(离心半径15 cm)离心5 min, 取上清液。

3.Vit C干扰样本的制备 先用双蒸水制备100 g/L的Vit C冷溶液作为储存液(配制过程中最大限度避免接触空气), 再以储存液为基础分别配制高值样本(1 g/L)和低值样本(0 g/L); 然后再按不同比例对高值样本和低值样本进行混合, 得到系列浓度Vit C干扰样本, Vit C浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1 g/L。

4.脂血干扰样本的制备 先分别制备高值样本(1%Intralipid)和低值样本(对照人血清), 再按不同比例对高值样本和低值样本进行混合, 得到系列浓度脂血干扰样本, Intralipid浓度为1%、0.5%、0.25%、0.125%、低值样本(分别相当于乳糜浓度10、5、2.5、1.25、0 g/L)。

5.Hb干扰样本的制备 先制备10 g/L的Hb血清作为储存液, 再用储存液制备高值样本(10g/L)和低值样本(对照人血清), 然后再按不同比例对高值样本和低值样本进行混合, 得到系列浓度Hb干扰样本, Hb浓度为10、8、4、2、1 g/L、低值样本。

6.黄疸干扰样本的制备 先制备FBil和CBil储存液, 再用储存液分别制备FBil高值样本(0.4 g/L)和CBil高值样本(0.4 g/L), 然后再用高值样本和低值样本不同比例进行混合, 得到系列浓度黄疸干扰样本, FBil或CBil浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 g/L、低值样本。

7.操作 将原GSP试剂R1中加入ON-50, 工作液浓度为1‰ , 标记为改进试剂。样本的具体上机顺序:高值→ 低值、低值→ 高值、高值→ 低值、低值→ 高值、高值→ 低值。所有干扰样本制备后, 在最佳仪器条件下, 分别使用原装试剂和改进试剂在2 h内对制备好的Vit C干扰样本进行测定, 2种试剂的测定条件一致, 每个样本连续测定8次。

8.统计学方法 产生的具有明显偏差的样本, 应剔除, 或重新进行测定。计算每个样本测定的平均值( x-)、标准差(s)和变异系数(CV), CV应≤ 10%。按照下面的公式, 继续进行数据处理, 以保证干扰实验是在精密度在控的条件下进行。相对偏差(Bias)(%)=(干扰样本的测定均值-对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值× 100%。Bias应≤ 10%。对照样本即是每个梯度中的低值样本。当CV≥ 10%、Bias≥ 10%所对应的临界干扰样本浓度, 即为本试剂盒所能耐受的最大干扰。

二、结果

1. 改进前乳糜浓度≤ 5 g/L(相当于Intralipid 5 g/L)时对GSP的测定结果没有影响, 而改进后乳糜浓度≤ 10 g/L(相当于Intralipid 10 g/L)时对GSP的测定结果没有影响。见表1。

表1 GSP试剂盒乳糜干扰实验

2.当Vit C浓度≤ 0.1 g/L时试剂改进前、后均对GSP的测定结果没有影响, 见表2。

表2 GSP试剂盒Vit C、Hb、FBil、CBil干扰实验

3.当Hb≤ 2 g/L时, 试剂改进前、后均对GSP的测定结果有影响, 见表2。

4.改进前FBil≤ 0.05 g/L时, 对GSP的测定结果没有影响。而改进后FBil≤ 0.2 g/L时, 对GSP试剂盒的测定结果没有影响。改进前CBil≤ 0.1 g/L时, 对GSP的测定结果没有影响。而改进后CBil≤ 0.2 g/L时, 对GSP试剂盒的测定结果没有影响。见表2。

三、讨论

本研究显示, 在对原试剂进行了改进后, GSP试剂测定脂血和黄疸样本的抗干扰能力有了显著的改善。改进前乳糜浓度≤ 5 g/L, 改进后提高到≤ 10 g/L; 改进前FBil≤ 0.05 g/L, 改进后提高到≤ 0.2 g/L; 改进前CBil≤ 0.1 g/L, 改进后提高到≤ 0.2 g/L, 对GSP的测定结果没有影响。其作用基理是ON-50作为表面活性剂而表现出的增溶作用。在体系中形成胶束后具有能使不溶或微溶于水的有机物的溶解度显著增大的能力, 且此时溶液呈透明状, 避免了测定过程中对特殊波长光波的阻挡和吸收。增溶作用可使被增溶物的化学势显著降低, 使体系变得更稳定, 只要外界条件不变, 体系不随时间变化, 最终达到了抗干扰之目的。

对于Vit C和Hb形成的干扰没有明显的改善, 虽然这种改进未能全方面地提高GSP测定过程中的抗干扰能力。但其重要的临床意义在于, 我们可以告诫患者在检查此项目前人为地少进食Vit C或者富含Vit C食物或药物; 在采集样本时也可人为避免溶血而造成的高浓度Hb形成的干扰。而对脂血和黄疸患者我们却能够比较理想地排除样本带来的偏差和影响, 从而使该项目的检测数据更真实、准确, 也为临床提供更有意义的诊断依据, 这是非常可贵和具有现实意义的。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Cefalu WT, Bell-Farrow AD, Petty M , et al. Clinical validation of a second-generation fructosamine assay[J]. Clin Chem, 1991, 37(7): 1252-1256. [本文引用:1] [JCR: 7.149]
[2] Schleicher E, Wiel OH. Specific quantitation by HPLC of protein (lysine) bound glucose in human serum albumin and other glycosylated proteins[J]. J Clin Chem Clin Biochem, 1981, 19(2): 81-87. [本文引用:1]