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唐振华, 李柱南, 王进进, 胡伟平, 黄勇. 实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因表达. 25(3): 196-199
TANG Zhenhua, LI Zhunan, WANG Jinjin, HU Weiping, HUANG Yong. Expression of TSLC1 gene in cervical tissue by real-time fluorescence PCR. Labratory Medicine, 25(3): 196-199  
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实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因表达
唐振华, 李柱南, 王进进, 胡伟平, 黄勇
中国福利会国际和平妇幼保健院,上海 200030

作者简介：唐振华,男,1960年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物与免疫检验工作。

摘要
目的

建立检测肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因mRNA表达的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法。

方法

设计特异性引物和TaqMan探针,以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为对照,建立检测TSLC1基因表达的实时荧光PCR方法,并采用细胞株和宫颈组织样本进行验证。

结果

该方法检测TSLC1基因 mRNA的检测下限为每反应10个细胞或2拷贝cDNA, 总不精密度为3.1%。TSLC1基因mRNA在子宫肌瘤、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)与宫颈癌患者宫颈组织中的表达率分别为100%、75%、55%和24%。宫颈癌细胞株中未检出TSLC1基因mRNA表达。所有样本中均有GAPDH基因mRNA表达。

结论

该实时荧光PCR方法能够有效检测TSLC1基因mRNA表达,是进一步研究TSLC1基因在宫颈癌发生中的作用及宫颈癌早期诊断的重要工具。

关键词: 实时荧光聚合酶链反应; TSLC1基因; 宫颈癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)03-0196-04
Expression of TSLC1 gene in cervical tissue by real-time fluorescence PCR
TANG Zhenhua, LI Zhunan, WANG Jinjin, HU Weiping, HUANG Yong
The International Peace Maternity and Child Health Hospital, the China Welfare Institute, Shanghai 200030,China
Abstract
Objective

To establish real-time fluorescence polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of tumor suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) mRNA expression.

Methods

The real-time fluorescence PCR method for the detection of TSLC1 gene expression was established with designed specific primers, TaqMan probe and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as control, and verified by cell lines and cervical tissue samples.

Results

The detection limit of TSLC1 gene mRNA was 10 cells per reaction,or 2 copies of cDNA. The total imprecision of this method was 3.1%. The TSLC1 gene mRNA expression rates in cervical tissue of the patients with hysteromyoma, low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and cervical cancer were 100%, 75%, 55% and 24%,respectively. TSLC1 gene mRNA expression was not found in cervical cancer cell lines. GAPDH gene mRNA expression was positive in all samples.

Conclusions

The real-time fluorescence PCR method can effectively detect mRNA expression of TSLC1 gene and is an important tool for a further study of the effect of TSLC1 gene in cervical cancer development and the early diagnosis of cervical cancer.

Keyword: Real-time fluorescence polymerase chain reaction; TSLC1 gene; Cervical cancer

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是宫颈癌的最初诱发因素[1], 但从感染HPV到宫颈癌的发生过程目前还不清楚。抑癌基因和原癌基因的遗传改变是参与这一过程的重要因素。肺癌肿瘤抑制因子1(tumor suppressor in lung cancer 1, TSLC1)基因是最初在肺癌中发现的抑癌基因, 与多种肿瘤的发生有关[2], 在宫颈癌组织中表达缺失[3]。我们建立了检测TSLC1基因表达的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法, 为进一步研究TSLC1基因在肿瘤发生中的作用奠定基础。

材料和方法
一、细胞株、患者及样本

宫颈癌细胞株(HeLa)由复旦大学遗传所惠赠。宫颈组织样本来自中国福彩会国际和平妇幼保健院活检或手术患者, 宫颈癌患者33例(鳞癌29例, 腺癌4例), 高度鳞状上皮细胞内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)与低度鳞状上皮细胞内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)患者各20例。所有患者均经过病理检测证实, 年龄38~59岁。另有20例子宫肌瘤患者宫颈样本作为对照。正常全血样本由本研究组人员自愿提供。

二、主要仪器与试剂

Prism 7500实时荧光PCR仪(美国应用生物系统公司); Trizol试剂购自Sigma公司; PCR反应试剂购自TaKaRa公司。

三、引物与探针

引物与探针序列采用Oligo 6.0 软件设计, 目的基因TSLC1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及探针序列见表1。

四、RNA提取

组织样本采用激光俘获显微切割方法分离约106个肿瘤细胞进行研磨, 然后采用Trizol试剂提取mRNA, 按照说明书进行提取。细胞株直接采用Trizol试剂提取mRNA。

五、实时荧光PCR

TSLC1 mRNA与内参照GAPDH mRNA分别在独立的扩增管中进行扩增。在PCR反应体系中加入引物和探针各0.5 μ mol/L, mRNA模板5 μ L, 总反应体积为30 μ L。反应条件为:首先在42 ℃反转录30 min, 95 ℃变性2 min, 然后95 ℃ 30 s, 55 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s扩增40个循环。在55 ℃采集荧光信号。采用Prism 7500专用软件进行数据分析。

六、统计学方法

所有统计分析均采用SPSS 13.0 软件进行, 基因表达差异采用χ 2检验。

表1 引物与探针
结果
一、扩增效率

采用合成的cDNA片段进行PCR扩增效率测定。TSLC1与GAPDH扩增效率分别为1.92与1.98, 两者扩增效率基本一致。

二、灵敏度

采用2组实验确定实时荧光PCR的检测下限。首先确定检测cDNA的灵敏度, 采用合成的cDNA片段进行PCR扩增灵敏度分析。将cDNA稀释成107~102拷贝/mL, 加入2 μ L进行实时PCR扩增, 灵敏度可以达到103拷贝/mL, 即每个反应体系2个cDNA拷贝。然后确定检测细胞悬液的灵敏度, 将正常全血样本分离白细胞后稀释为106、105、104、103、102、10个细胞/mL的悬液。各取1 mL离心收集细胞后提取mRNA, 提取产物稀释为50 μ L。取5 μ L加入反应体系进行反转录和PCR扩增。每个稀释度的样本进行5次重复, 结果见图1。灵敏度可达到102个细胞/mL, 即每个反应体系中包含10个细胞的mRNA。

图1 实时荧光PCR检测TSLC1基因mRNA表达的梯度稀释结果

三、不精密度

采用浓度为104个细胞/mL的正常白细胞悬液进行PCR扩增的不精密度测定。取1 mL细胞悬液离心收集细胞后提取mRNA, 提取产物稀释为50 μ L, 取5 μ L加入反应体系进行逆转录和PCR扩增, 每次检测采用10个重复, 连续检测 5 d, 计算阈值循环数(Ct)值的变异系数(CV)。同一次扩增的CV为1.2%(图2), 总CV为3.1%。

图2 实时荧光PCR检测TSLC1基因mRNA表达的重复性

四、TSLC1基因在宫颈癌细胞株中的表达

分别培养的5株细胞分别检测3次, 均未发现有TSLC1基因表达, 而GAPDH基因在所有细胞株中均出现表达。

五、TSLC1基因在宫颈组织中的表达

采用所建立的实时PCR方法检测各类宫颈组织中TSLC1基因的表达率结果见表2。宫颈癌样本中只有24%表达TSLC1基因。

表2 各种宫颈组织中TSLC1基因的表达
讨论

宫颈癌发生中涉及到多种抑癌基因表达降低或缺失。TSLC1基因是在非小细胞肺癌中发现的抑癌基因, 位于染色体11q23.2, 其编码产物为免疫球蛋白超家族蛋白, 参与细胞间的相互作用[4]。在肿瘤组织中, TSLC1基因常常出现启动子区超甲基化或杂合缺失, 从而使其表达程度显著降低或者表达缺失[5]。TSLC1表达缺失与多种肿瘤的发生有关, 在肺小细胞肺癌、食管癌以及宫颈癌中都发现明显的TSLC1表达缺失[6~8]。

目前公认HPV感染是宫颈癌发生的触发因素, 但仅仅HPV感染并不能导致宫颈癌的发生, 感染HPV的妇女只有一小部分会发展成为宫颈癌[1]。如何在HPV感染后尽早区分有可能发展成为宫颈癌的患者, 并针对性地进行早期干预, 一直是国内外研究的热点问题。其中抑癌基因的甲基化、杂合缺失和表达缺失是近年来研究的重点, 其目标之一就是寻找能够早期区分不同发展方向的癌前病变。本研究建立检测TSLC1基因mRNA表达的实时荧光PCR, 灵敏度可以达到每反应10个细胞, 总不精密度为3.1%。可以作为检测TSLC1基因表达的可靠工具, 为进一步研究TSLC1基因在肿瘤发生中的作用奠定了基础。另外, 实时荧光PCR已经成为临床实验室的常规手段, 一旦能够确定TSLC1基因表达的临床价值, 本研究即能方便地应用到临床实践。

有关TSLC1基因表达与宫颈癌发生的研究尚不多见。Steenbergen等[3]于2004年首先报道TSLC1基因表达缺失与宫颈癌发生有关。Yang等[9]报道TSLC1基因在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(cervical infraepithelial neoplasia, CIN) I、CIN II、CIN III和宫颈癌中的表达率分别为100%、78%、74%、26%和23%。由于在早期的癌前病变中存在TSLC1基因表达缺失, 因此认为TSLC1基因失活可能参与了宫颈癌的早期发生过程。本研究采用所建立的实时荧光PCR检测各类宫颈组织, 发现在正常组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中TSLC1基因的表达率分别为100%、75%、55%和24%, 这一结果与Yang等[9]的报道基本一致。然而, HPV感染患者如果发生TSLC1基因表达缺失, 是否更容易发展成为宫颈癌, 还需要长期的跟踪研究才能确定。

总之, 本研究建立的检测TSLC1基因mRNA表达的实时荧光PCR方法灵敏度较高, 重复性好, 可以作为进一步研究TSLC1基因表达在肿瘤早期诊断中的价值的重要工具。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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