引用本文
应春妹, 沈文艳, 汪雅萍, 叶杨芹, 张灏旻. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产色培养基临床应用评估. 25(3): 188-191
YING Chunmei, SHEN Wenyan, WANG Yaping, YE Yangqin, ZHANG Haomin. Application evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus . Labratory Medicine, 25(3): 188-191  
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产色培养基临床应用评估
应春妹, 沈文艳, 汪雅萍, 叶杨芹, 张灏旻
上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200127

作者简介：应春妹,女,1967年生,硕士,主任技师,主要从事临床微生物检验及细菌耐药性监测工作。

摘要
目的

通过头孢西丁纸片法、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)产色筛选平板法和聚合酶链反应(PCR)检测MRSA,评估MRSA产色筛选平板的敏感性和特异性。

方法

收集仁济医院2008年8月至9月临床分离的金黄色葡萄球菌68株,分别采用头孢西丁纸片法、MRSA产色筛选平板法和PCR检测MRSA,以PCR检测femA基因和mecA基因结果为金标准,比较MRSA产色筛选平板的敏感性和特异性。

结果

甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)除万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺外,对其他11种抗菌药物的敏感率明显高于MRSA。68株金黄色葡萄球菌中,头孢西丁纸片法筛选出 50株MRSA,产色平板法筛选出51株MRSA,PCR检测到51株mecA基因阳性,MRSA产色筛选平板结果和mecA基因检测结果符合率为100%。

结论

MRSA产色筛选平板可用于临床快速检测MRSA。

关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 产色筛选平板; mecA基因
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)03-0188-04
Application evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus
YING Chunmei, SHEN Wenyan, WANG Yaping, YE Yangqin, ZHANG Haomin
Department of Clinical Laboratory, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China
Abstract
Objective

To evaluate the sensitivity and specificity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) chromogenic agar medium by cefoxitin disk test and polymerase chain reaction (PCR) amplification of MRSA genes.

Methods

68 Staphylococcus aureus strains from clinical isolates were collected from August to September 2008 in Renji hospital. The sensitivity and specificity of the MRSA chromogenic agar medium were compared with PCR standard method. MRSA were determined by cefoxitin disk test, MRSA chromogenic agar medium and PCR amplification.

Results

The sensitivity of 11 antibiotics from methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) strains was significantly higher than that from MRSA strains except the other three tested antibiotics such as vancomycin, teicoplanin and linezolid. In the 68 tested Staphylococcus aureus strains,50 strains were positive from MRSA strains by cefoxitin disk test,while 51 strains were positive for MRSA strains by chromogenic agar medium test and 51 strains were positive for mecA gene by PCR amplification. The results of MRSA chromogenic agar medium test were the same as those of PCR amplification for mecA gene.

Conclusions

MRSA chromogenic agar medium test can be used in fast detection of clinical MRSA strains.

Keyword: Staphylococcus aureus; methicillin-resistant; Chromogenic agar medium; MecA gene

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院感染的主要病原菌之一, 并可引起医院感染的暴发流行。MRSA对多种抗菌药物耐药, 仅对糖肽类抗菌药物敏感。但90年代后期出现了对万古霉素敏感性下降的MRSA(VISA), 2002年起美国相继报道了耐万古霉素MRSA(VRSA)[1, 2], MRSA感染给临床治疗带来很大困难, 已成为革兰阳性菌中的超级细菌。

2006年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐常规检测MRSA的实验方法为头孢西丁纸片法[3]。聚合酶链反应(PCR)检测mecA基因为检测MRSA的金标准方法, 因试剂成本较高, 一般较难在临床常规开展。MRSA产色筛选平板法因操作简单, 目前已在许多实验室应用。本研究以mecA基因检测为金标准, 评估MRSA产色筛选平板法在临床应用的敏感性和特异性。

材料和方法
一、材料

1. 试验菌株 收集仁济医院2008年 8月至 9月引起院内感染的金黄色葡萄球菌 68株。

2.抗菌药物纸片 庆大霉素、青霉素、氨苄西林-舒巴坦、头孢唑啉、利奈唑胺、左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、克林霉素、复方磺胺甲口恶唑、磷霉素、利福平、替考拉宁和头孢西丁均购于美国Oxoid公司。

3. MRSA 产色筛选平板 购自上海祥和科技有限公司。

4. PCR相关试剂 购自上海闪晶生物科技有限公司。mecA和femA 基因引物见表1[4]。

表1 mecA 和 femA 基因引物序列和扩增产物片段

5.仪器 美国BD公司Phoenix-100 全自动微生物鉴定仪和美国PE 公司ABI 7000全自动PCR扩增仪。

二、方法

1. 菌株鉴定 所有菌株均经Phoenix-100全自动微生物鉴定仪鉴定。

2. 药敏纸片法 采用CLSI推荐纸片扩散法法[3], 菌液浓度为0.5 麦氏浊度, 结果判定标准为CLSI 2006年版标准, 数据用WHONET 5.3进行统计分析。

3. 头孢西丁MRSA表型检测 根据CLSI 2006年版, 用纸片扩散法检测头孢西丁抑菌圈直径, 头孢西丁抑菌圈直径≤ 19 mm为 MRSA, 抑菌圈直径≥ 20 mm为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。

4. 产色平板筛选试验 挑取纯菌落, 接种MRSA产色培养基, 孵育18~24 h, 出现绿色菌落为MRSA。如果为阴性, 继续孵育24 h。

5. 细菌DNA抽提 从血平板上挑取3~4个菌落 , 加入300 μ L 0.85%的氯化钠溶液中, 制成细菌悬液, 混匀。以10 000 r/ min(离心半径为8 cm)离心5 min, 弃去上清液, 加入300 μ L无菌双蒸水, 混匀。细菌悬液100 ℃ 15 min水浴后, 以12 000 r/ min(离心半径为8 cm)离心2 min, 弃去上清液, 取3 μ L沉淀作为DNA模板。

6. PCR反应 mecAM1、mecAM2、femAC1、femAC2引物由上海闪晶生物科技有限公司合成。两基因检测的反应条件相同[4]。PCR 反应总体积为50 μ L, 含 3 μ L DNA 模板, 2 μ L 1 U/mL Taq 酶(由上海闪晶生物科技有限公司提供)、45 μ L PCR 反应液(含dNTP混合物各0.2 mmol/L, 1.5 mmol/L MgCl2以及各1.25 μ mol/L mecA和femA引物)。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸60 s, 共30个循环, 72 ℃ 延伸3 min。PCR Marker为SG2000 DNA Ladder, 由上海闪晶分子生物技术研究所提供。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳, 120 mV 1 h, 溴化乙啶染色, 在透射紫外仪下照相观察。

三、统计学方法

采用WHONET 5.3进行统计, 用χ 2检验对MRSA和MSSA的耐药率进行比较。

结果
一、药物敏感试验结果

68株金黄色葡萄球菌中MRSA 50株, MSSA 18株, 其中MSSA除万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺外, 对其他11种抗菌药物的敏感率明显高于MRSA, 见表2。MSSA对氨基糖苷类、β -内酰胺类、氟喹诺酮类、磷霉素、克林霉素、红霉素和复方磺胺甲口恶唑等抗菌药物敏感率均显著高于MRSA。统计学发现, MRSA 和 MSSA对青霉素、利奈唑胺、万古霉素和替考拉宁的敏感性差异无统计学意义。

表2 50株MRSA和18株MSSA对14种抗菌药物的耐药率和敏感率
二、MRSA检测结果

68株金黄色葡萄球菌经头孢西丁纸片法检测, 筛选出 50株MRSA, 检出率为73.5%(50/68)。产色平板筛选出51株MRSA, 检出率为75.0%(51/68)。PCR检测到51株mecA基因阳性, MRSA产色筛选平板结果和mecA基因检测结果符合率为100%, 见图1。MRSA的femA基因均为阳性, 3株MSSA的femA基因阴性, 见图2。

图1 17株金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测结果

图2 7株金黄色葡萄球菌femA基因PCR检测结果

讨论

金黄色葡萄球菌是引起院内感染的主要致病菌, 引起医院内和患者间广泛传播。近年来, MRSA的感染率逐年升高。MRSA感染一旦出现, 极易造成病室内流行, 同一克隆的MRSA可以在同一病房或一个医院、一个地区引起暴发流行。故及时检测MRSA对于指导临床治疗非常重要。

femA基因为葡萄球菌的标志基因[5], PCR检测femA基因, 有3株MSSA的femA基因阴性, 但在协同凝集和甘露醇发酵试验均显示此3株菌为葡萄球菌。Kobayashi等[6]报道, 尽管在金黄色葡萄球菌可检测到femA基因, 但femA基因不表达并不意味着不是金黄色葡萄球菌。本实验显示, 有4%的金黄色葡萄球菌不表达femA基因, 和在Kobayashi先前的研究一致, 证实了这个现象。另外femA基因阴性与PCR检测存在一定假阴性有关, 可能还须进行重复试验。

常规MRSA的检测通常选用头孢西丁纸片扩散法。该方法受纸片储存条件、平板厚度和孵育时间等影响, 当最低抑菌浓度在临界值时, 结果判断就比较困难。PCR检测mecA基因为检测MRSA的金标准方法, 但试剂成本较高, 且需要一定的实验条件, 一般较难在临床常规开展。产色筛选平板法因操作简单, 目前已在许多实验室应用, 该方法为梅里埃公司近几年研发的快速检测耐药基因中的一种方法, 其原理主要是在头孢西丁存在的情况下, 产α -葡萄糖苷酶的菌落(生物梅里埃专利)自发呈现绿色, 从而达到直接鉴定的目的。产色筛选平板法可将标本直接接种在琼脂上或先于肉汤中增菌后再接种到琼脂上, 减少鉴定的时间, 但对应头孢西丁最低抑菌浓度较低(≤ 4 mg/L)而具有mecA基因的金黄色葡萄球菌, 该法可能阴性, 或某些凝固酶阴性葡萄球菌也可能产生浅绿色菌落[7]。本试验结果显示, 产色筛选平板和PCR比较其敏感性和特异性均为100%, 但实验过程中发现有2株存在弱阳性结果, 经重复试验后判断为MRSA阴性, 与PCR结果一致。

PCR检测mecA和femA基因是一个非常敏感和特异的方法, 可在24 h内得到结果。mecA基因阳性可以作为MRSA的确证试验, 因此PCR可作为MRSA检测的金标准。产色筛选平板法与PCR金标准检测相比, 敏感性和特异性均较一致, 提示产色筛选平板法适合在临床实验室常规开展, 是院内感染MRSA监测的一种可靠、实用的检测方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] Centers for Disease Control Prevention(CDC). Vancomycin-resistant Staphylococcus arueus Pen-nsylvania, 2002[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2002, 51(40): 902. [本文引用:1]
[3] Clinical Laboratoty Stand ards Institute. Perfor-mance stand ards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S15, CLSI, 2006. [本文引用:2]
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[6] Kobayashi N, Wu H, Kojima K, et al. Detection of mecA, femA and femB genes in clinical strains of Staphylococci using polymerase chain reaction[J]. Epidemiol Infect, 1994, 113(2): 259-266. [本文引用:1] [JCR: 2.867]
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