引用本文
邓维秀, 李亚玲, 唐微. 血平板分离培养细菌L型的生物学特性. 25(3): 185-187
DENG Weixiu, LI Yaling, TANG Wei. Biological characteristics of bacterial L-forms isolated and cultured with blood plates. Labratory Medicine, 25(3): 185-187  
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《检验医学》编辑部
血平板分离培养细菌L型的生物学特性
邓维秀1, 李亚玲2, 唐微3
1. 郧阳医学院免疫学教研室,湖北 十堰 442000
2. 郧阳医学院附属太和医院内分泌血管外科,湖北 十堰 442000
3. 郧阳医学院生物化学教研室,湖北 十堰 442000

作者简介：邓维秀,女,1952年生,学士,教授,主要从事细菌L型及黏膜免疫研究。

摘要
目的

了解血平板分离培养细菌L型的特性及其漏检原因。

方法

201份标本直接接种于血平板培养,盲刮盲扩后取针尖样或云雾状菌落,干片固定观察菌落特征;常规法鉴定L型及其生化特性。

结果

分离出102株L型(50.7%),针尖样菌落57份,云雾状菌落45份,L型多为颗粒型(G型)菌落(81%),易回复(88%);超薄切片细胞壁缺失;生化反应减弱;金黄色葡萄球菌L型居首位(50%)。

结论

血平板可直接用于分离培养L型,能保持传统培养L型的多种特性,有利于临床标本同时检出细菌型和L型,可提高L型的检出率。

关键词: 血平板; 细菌L型; 生物学特性
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)03-0185-03
Biological characteristics of bacterial L-forms isolated and cultured with blood plates
DENG Weixiu1, LI Yaling2, TANG Wei3
1. Department of Immunology, Yunyang Medical College, Hubei Shiyan 442000, China
2. Department of Endocrine and Vascular Surgery, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Hubei Shiyan 442000, China
3.Department of Biochemistry, Yunyang Medical College, Hubei Shiyan 442000, China
Abstract
Objective

To investigate the characteristics of bacterial L-forms isolated and cultured with blood plates and the causes of the failure detection.

Methods

201 specimens were directly inoculated on blood plates to observe their growth. By blind smearing and blind spreading, the pinpoint-shaped and cloudy colonies were taken and their characteristics were observed through the method of dry-up fixation. Those L-forms were identified with routine methods and their biochemical characteristics were determined.

Results

102 strains (50.7%) of L-forms were isolated and identified including 57 pinpoint-shaped colonies and 45 cloudy colonies. They were mainly granular form colonies(G-form,81%)and easy to revert(88%). The ultrastructures of L-forms were shown to be deficient in cell walls. Biochemical reactions of L-forms decreased. The L-forms of Staphylococcus aureus ranked first (50%).

Conclusions

Blood plates are directly used to isolate and culture L-forms. The traditional L-forms characteristics are maintained. It is beneficial to detect the clinical specimens to be bacteria-form and L-forms simultaneously and it can increase the positive rates of detection of L-forms by blood plates.

Keyword: Blood plate; Bacterial L-form; Biological characteristic

细菌 L型是细菌细胞壁缺陷的细菌, 其致病特点及感染的意义已有报道[1]。L型因缺壁程度不同而具有形态多形性、菌落多样性、生化反应多变性等特点, 难以识别。L型培养多用改良Kagan培养基, 少数用非高渗培养基[2]。我们最初用血平板培养检出L型, 能保持传统培养L型的多种特性[3]。为进一步证实其培养L型的生物特性, 我们采集201份临床标本, 进行L型生长、形态染色、生化特性等观察, 为临床采用简便易行的培养L型方法及寻找其漏检原因, 同时为提高L型检出率提供理论依据。

材料和方法
一、材料

1. 标本 于太和医院采集耳、鼻、咽炎拭子64例, 女性生殖道炎宫颈拭子41例, 手术摘除阑尾组织30例, 慢性淋病尿道口分泌物66例, 共201例, 男118例, 女83例, 年龄2个月~60岁。

2. 培养基 血琼脂平板、等渗液体培养基由太和医院检验部提供。

3. 主要试剂 药敏纸片等购于上海生化试剂所。

二、方法

1. 细菌L型分离与鉴定 标本分离, 划线于血平板, 37 ℃培养18~24 h, 肉眼观察有否针尖样及云雾状生长后采用盲刮盲扩法[1]。取针尖样生长的琼脂小块, 经L型菌落干片固定法Dienes染色, 低倍镜观察菌落特征; 涂片革兰染色和细胞壁染色观察形态及缺壁情况; 传代培养、通过0.22 μ m孔径滤器、回复试验及电镜鉴定为L型。盲刮涂片以同法观察及鉴定。

2. 回复(返祖)试验 自行和传代相结合法[3] , 将传代培养的血平板用胶布封固4~6 h, 再转种血平板, 37 ℃培养观察菌落情况, 决定是否再封固及移种。

3. 回复菌鉴定 经回复试验后生长的细菌视为回复菌, 按文献[4]鉴定菌种。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行t检验。

结果
一、细菌L型生长特性及形态与染色

标本接种于血平板37 ℃培养24~48 h后, 盲刮盲扩培养18~24 h, 分离出细菌L型共102株(50.7%)。针尖样菌落57份(55.8%), 其中Dienes染色38份为G型, 15份为L型(油煎蛋样), 4份为F型(丝状样)菌落; 云雾状菌落45份(44.1%), 均为G型菌落。两者呈革兰阳性或阴性球、杆状, 缺壁浓染; 过滤性阳性; 电镜观察缺乏细胞壁结构。

二、细菌L型生化特性

45株金黄色葡萄球菌L型, 30株血浆凝固酶弱阳性, 9株为阴性, 均迟缓发酵甘露醇; 6株为阳性。7株大肠埃希菌L型迟缓发酵醇类(甘露醇等)及糖类(鼠李糖、葡萄糖等), 5株甲基红及吲哚试验阴性, 2株为阳性。

三、细菌L型回复性

102株L型菌中45株云雾状菌落及12株针尖样菌落传1~2代回复为细菌型, 余45株传3~10代未回复, 经自行和传代法其中20株传1~2代, 13株传3~10代均回复为细菌型, 回复率为88%; 12株传10代以上未回复。

四、细菌L型菌种分布

102株L型菌90株回复鉴定菌种:金黄色葡萄球菌45株; A群溶血性链球菌7株; 甲型溶血性链球菌5株; 大肠埃希菌7株; 屎链球菌和微球菌各2株; 淋球菌13株; 肺炎链球菌、白念珠菌和产碱假单胞菌各2株; 奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌各1株。

讨论

201份标本血平板培养物中可见针尖样菌落57份, 云雾状菌落45份, 共102株被判为L型(50.7%), 表明血平板可直接用于临床标本分离培养L型。关键是仔细识别特殊菌落。新近的研究提示, L型在血平板能生长, 但菌落非常小, 涂片染色呈明显的缺壁和多形性[1]。57份针尖样菌落中38份及45份云雾状菌落Dienes染色均为G型(81%)。Pins等[5]报道女性生殖道炎标本厌氧血琼脂培养的针尖样菌落显微镜观察与琼脂Dienes染色的L型相似。针尖样及云雾状菌落生长慢而小, 易被忽视。我们采用盲刮涂片革兰及细胞壁染色, 提前查到肉眼看不见的细菌或L型菌; 盲扩缩短培养时间, 利于同时检出细菌型和L型, 提高L型检出率, 有助于临床诊断。值得一提的是针尖样菌落细小较硬, 不易刮取, 涂片染色及药敏试验时应加以注意。云雾状菌落出现较针尖样菌落早但模糊不清, 需迎着光线仔细观察才能发现。盲刮盲扩越早进行越能快速检出L型。

细菌L型根据是否能回复分为稳定、相对稳定和不稳定型[6]。本结果12株L型未能回复。本研究金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌L型生化反应均减弱, 提示临床不能用常规生化反应编码来鉴定L型而获得统一的生化特性。从细菌L型菌种分布的结果来看, L型以金黄色葡萄球菌居首位, 与报道该菌在临床引起的各类感染较常见相一致。说明血平板适宜各种L型分离培养, 并保持传统培养L型的多种特性。我们还发现, 部分金黄色葡萄球菌L型(针尖样菌落)涂片革兰染色呈阳性棒状, 但经多次传代可回复为原菌。建议涂片染色见此形态应反复传代鉴定出菌种, 否则会误认为类白喉杆菌而延误临床诊断, 该现象出现的原因尚待研讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 林特夫, 黄谷良. 细菌L型感染的意义和研究进展(四)——细菌 L型的检验和鉴定[J]. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(2): 127-131. [本文引用:3]
[2] 易旭, 王和. 细胞壁缺陷白喉棒状杆菌致病作用的观察及其毒力基因检测[J]. 中国微生态学杂志, 2007, 19(3): 270-272. [本文引用:1]
[3] 邓维秀. 血平板针尖样及云雾状菌落分离与鉴定[J]. 微生物学通报, 1998, 25(3): 153-156. [本文引用:2]
[4] 邓维秀, 赵均秀. 血沉增快与细菌L型关系的探讨——溶血培养细菌L型[J]. 上海医学检验杂志, 2000, 15(6): 369-370. [本文引用:1]
[5] Pins MR, Holden JM, Yang JM, et al. Isolation of pre-sumptive Streptobacillus moniliformis from abscesses associated with the female genital tract[J]. Clin Infect Dis, 1996, 22(3): 471-476. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[6] Domingue GJ. Cell wall-deficient bacteria[M]. London: Addison-wesley Publishing Company, 1982: 1-3, 43, 106-109. [本文引用:1]