引用本文
江虹, 曾婷婷, 刘怡玲, 吕瑞雪, 左永太, 庄利芳. 未成熟粒细胞检测的评估及参考范围的建立. 25(3): 171-175
JIANG Hong, ZENG Tingting, LIU Yiling, LÜ Ruixue, ZUO Yongtai, ZHUANG Lifang. Evaluation of immature granulocyte determination and establishment of its reference range. Labratory Medicine, 25(3): 171-175  
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《检验医学》编辑部
未成熟粒细胞检测的评估及参考范围的建立
江虹1, 曾婷婷1, 刘怡玲2, 吕瑞雪2, 左永太1, 庄利芳1
1.四川大学华西医院实验医学科,四川 成都 610041
2.四川大学华西临床医学院检验系,四川成都 610041

作者简介：江虹,女,1966年生,学士,副教授,主要从事血液学检验的临床和教学工作。

摘要
目的

探讨血液分析仪定量检测不成熟粒细胞(IG)指数的临床应用;建立本实验室应用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪进行IG检测的正常参考值范围。

方法

应用临床标本连续测定20次,观察其批内精密度;用2个水平质控物连续测定20 d,观察其批间精密度;分别应用血液分析仪和流式细胞仪对101例标本进行IG指数测定,对其结果进行相关性回归分析和一致性比较;对883例全血标本分别用血液分析仪进行自动幼稚粒细胞计数和手工推片染色后显微镜检分类,比较血液分析仪检测与显微镜镜检的一致性;以Sysmex XE-2100全自动血液分析仪和配套试剂盒测定766名健康者的IG值,以确立本室检测的参考范围。

结果

高、中、低值检测的批内精密度结果IG绝对计数的 CV值分别为4.78%、5.35%、13.06%,IG百分率的 CV值分别为3.82%、6.03%、14.54%;批间精密度2个水平的 CV值分别为IG绝对值4.38%、5.13%;IG百分率4.3%、5.1%,均<15%,在允许范围内。与流式细胞法比较具有良好相关性,相关系数( r)为0.916;与人工镜检比较的 r为0.890 3;年龄间比较各年龄组IG值间 P均>0.05,即年龄间差异无统计学意义;性别间比较 P<0.05,即性别间差异有统计学意义,分性别不分年龄建立本室IG检测的参考值范围为IG绝对值95%可信区间男(0,0.04×109/L);女(0,0.02×109/L)。IG百分率95%可信区间男(0,0.5%);女(0,0.4%)。

结论

临床应用血液分析仪定量检测IG方法可行,能为临床疾病的诊断和治疗监测提供实验室数据。各实验室应建立本实验室检测的参考值范围。

关键词: 不成熟粒细胞; 计数; 参考范围; 血液分析仪
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)03-0171-05
Evaluation of immature granulocyte determination and establishment of its reference range
JIANG Hong1, ZENG Tingting1, LIU Yiling2, LÜ Ruixue2, ZUO Yongtai1, ZHUANG Lifang1
1.Department of Laboratory Medicine, West China Hospital, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, China
2.Laboratory Department, West China School of Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, China
Abstract
Objective

To investigate the immature granulocyte (IG) count determination by the automated hematology analyzer in clinical application and establish a normal reference range of IG of our laboratory by Sysmex XE-2100 automated hematology analyzer.

Methods

A clinical sample was determined successively for 20 times to ensure the intra-batch precision; 2 quality controls were determined successively for 20 days to ensure the inter-batch precision. The IG counts of 101 specimens were determined by the Sysmex XE-2100 hematology analyzer and flow cytometry respectively,and the results were compared to evaluate the correlation. 883 whole blood specimens were determined and classified by the Sysmex XE-2100 hematology analyzer and manual microscopy respectively,and the results were compared to evaluate the consistency. 766 healthy subjects were determined by the Sysmex XE-2100 automated hematology analyzer for determining the IG count and establishing the reference range.

Results

The intra-batch coefficients of variation ( CV) of absolute IG counts of high, medium and low precision values were 4.78%,5.35% and 13.06% respectively. The intra-batch CVs of IG% were 3.82%,6.03% and 14.54% respectively. The inter-batch CVs of absolute IG counts of high and low values were 4.38% and 5.13% respectively. The inter-batch CVs of IG% were 4.3% and 5.1% respectively. All of them were within the tolerance limit (<15%). The correlation coefficient ( r) between Sysmex XE-2100 hematology analyzer and flow cytometry was 0.916, and that between Sysmex XE-2100 hematology analyzer and manual microscopy was 0.890 3. There was no significant difference between different ages ( P>0.05),but not between male and female ( P<0.05). IG reference ranges were established regardless of age. The absolute IG count reference range for male was (0,0.04×109/L), and for female it was (0, 0.02×109/L). The IG% reference range for male was (0,0.5%), and for female it was (0,0.4%).

Conclusions

Hematology analyzer can be used for IG count and provide data for diagnosis and therapy monitoring. Every clinical laboratory should establish its own reference range of IG count.

Keyword: Immature granulocyte; Count; Reference range; Hematology analyzer

不成熟粒细胞(immature granulocytes, IG)包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞和早幼粒细胞, 其在外周血中出现是骨髓造血功能增强、髓血屏障的破坏或出现髓外造血的重要信息, 是临床对炎症、血液病、成人和婴幼儿感染性疾病和败血症等疾病进行诊断、治疗监测和提示预后的重要参数[1, 2]。然而目前的文献报道对于核左移(IG增高)的标准不统一[3], 传统的幼稚粒细胞实验室诊断依靠手工推片染色, 使用显微镜观察, 不仅劳动强度大, 而且由于检测的白细胞(WBC)数量过少、检测者之间的个体差异以及细胞形态的判断标准不同而使得结果准确度较差, 重复性欠佳, 主观因素多[2]。Sysmex XE-2100全自动血液分析仪应用“ XE Pro” 和“ IG Master” 软件通过荧光染色技术对IG进行计数, 快速、简便地计数外周血的早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞并将这些细胞归并入“ IG计数” , 提供了一种可行的较为准确进行幼稚粒细胞计数的方法。由于使用血液分析仪检测IG在我国还未见应用于临床, 本研究对其临床应用可行性进行了探讨, 并对XE-2100血液分析仪定量检测IG进行方法学评估, 通过与流式细胞仪检测及手工镜检结果的比较, 分析Sysmex XE-2100全自动血液分析仪进行幼稚粒细胞检测的准确性。对于IG数量增高的判断有赖于参考值范围的建立, 这也是对多种疾病进行诊断和预后判断的基础[4], 故我们同时建立了本实验室IG检测的正常人参考值范围。

材料和方法
一、仪器与试剂

1.仪器 Sysmex XE-2100全自动血液分析仪(日本Sysmex公司); BD FACSCanto流式细胞仪(美国BD公司); Olympus光学显微镜。

2.试剂 血液分析仪检测IG试剂:Sysmex血液分析仪原装配套试剂; 流式细胞术检测IG测定试剂:CD16-异硫氰酸荧光素(CD16-FITC)、CD11b-藻红蛋白(CD11b-PE)、CD45-多甲藻黄素叶绿素蛋白(CD45-PerCP)单克隆抗体, 由美国BD公司提供。

二、样本

1.与流式细胞法比较的标本 选取四川大学华西医院门诊患者40例及住院患者61例(包括血液病患者25例), 其中初诊79例、复诊22例。

2.与手工镜检法比较的标本 选取四川大学华西医院门诊患者436例及住院患者447例(包括血液病患者49例), 其中初诊650例、复诊233例。

3.建立正常参考值的标本 四川大学华西医院健康体检者766名, 男383名, 女383名, 年龄在15~75岁之间(平均年龄为45岁)。

三、检测方法

1.血液分析仪法 Sysmex XE-2100全自动血液分析仪可自动检测外周血中的IG值, 并通过IG报警、绝对计数和散点图表示其异常。XE IG Master运用新开发的技术, 在WBC diff通道用自动阈值鉴别线把IG从成熟粒细胞中自动区分出来。应用一种聚次甲基染料可进入细胞使RNA和DNA着色。IG中的DNA含量较成熟粒细胞多, 所以具较强的荧光信号, 可被PMT(光电倍增管)所检测[5], 即导体激光流式细胞分析与核酸荧光染色法相结合从而达到对IG的定量检测。

2.流式细胞法 应用与粒细胞成熟程度关联的标志物来检测IG。WBC抗原CD45在不同WBC上的表达强度不同, 同时不同粒细胞因其细胞大小和所含颗粒不同产生不同的侧向散射光(SSC)。不成熟粒细胞不表达或极少表达CD11b, 粒细胞成熟到晚幼阶段CD11b表达逐渐增加, 而CD16则是直到晚幼粒阶段后才开始表达。有文献证实CD11b+CD16-细胞为晚幼粒细胞, CD11b+CD16+细胞为成熟粒细胞[5]。所以此次研究中我们将CD11b、CD16和CD45联合标记待测标本来检测其IG。应用CD16-FITC、CD11b-PE和CD45-PerCP单克隆抗体对标本进行标记后用流式细胞仪计数, 利用CD45和SSC圈出粒细胞, 并去除嗜酸性粒细胞。将CD16-CD11b+细胞确定为IG, 通过计算其和总WBC数比例得到IG百分比。

3.手工镜检法 由本室工作经验超过10年并有中级以上技术职称的技术人员按中华人民共和国卫生行业标准的WBC分类计数参考方法进行推片、染色、镜检。每份标本制备2张血涂片, 检验人员2人1组进行WBC分类计数(每人计数200个WBC, 共计400个WBC, 取均值为人工WBC分类值)及形态观察。

四、统计学方法

本研究采用SPSS 13.0软件分析检测值分布类型, 两样本配对t检验进行相关性分析, 选择多组秩和检验组间比较的方法对各影响因素进行验证。

结果
一、仪器性能评价

1.精密度 (1)批内精密度:取3份IG计数高、中、低值不同的抗凝血在室温下连续测定20次, 计算出s与CV%值。结果见表1; (2)批间精密度:每天同一时间检测水平2和水平3的e-CHECK质控品, 连续观察20 d, 其IG值的s与CV%值见表2。

表1 IG检测的批内精密度结果
表2 IG计数的批间精密度结果

2.携带污染率 取IG高(0.96× 109/L)值、低(0.03× 109/L)值标本各1份, 依次检测高值3次(i1, i2, i3)、再检测低值3次(j1, j2, j3), 求得携带污染率为1.2%, 可见结果受携带污染影响较小。

二、与其他临床检测相关性分析

1.XE-2100全自动血液分析仪与流式细胞仪定量检测幼稚粒细胞相关性比较 对101例标本分别使用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪和流式细胞仪进行幼稚粒细胞计数。对101例标本的流式细胞仪计数法和XE-2100计数结果进行相关性分析和两样本配对t检验分析。结果显示2种检测方法的幼稚粒细胞的百分比的相关性良好(r=0.915, 见图1), 对2种方法的结果进行两样本配对t检验, 差异无统计学意义(P> 0.05)。

图1 XE-2100与流式细胞仪IG百分比的相关性

2.XE-2100全自动血液分析仪与手工法检测幼稚粒细胞计数相关性比较 对883例全血标本分别用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪进行自动幼稚粒细胞计数和手工推片染色后进行手工分类, 手工分类由超过10年以上并有中级以上技术职称的技术人员严格按照操作规程进行, 每个标本由2名技术人员各推片、计数1次(2次误差控制在10%以内), 取均值。结果显示2种检测方法的幼稚粒细胞的百分比的相关性良好(r=0.890, 见图2)。

图2 XE-2100与手工法计数IG百分比的相关性

三、IG参考值范围的确立

选取正常健康者抗凝血标本766例, IG绝对值计数结果的年龄分布情况用图3表示。由图可知, IG的年龄分布趋势不为正态分布, 所以以年龄分组比较时用秩和检验进行两两比较。由于未知IG参考值建立有无性别差异, 所以分性别进行年龄分组比较。

图3 不同年龄组IG分布情况(n=766)

1. 分性别进行年龄间结果比较 选取766例标本中男、女各200例分别按年龄进行分组, 分为:15~30岁; 31~45岁; 46~60岁; 61~75岁。每组各50例。测定其IG绝对值和IG百分率并将结果进行各组间两两比较, 检验结果(见表3、表4)可见男女各年龄组间P均> 0.05, 各年龄组间IG参考值无差别。即可得IG参考值范围无年龄差异。

表3 男性各年龄组间IG绝对值和IG百分率检测结果两两比较秩和检验 (n=200)
表4 女性各年龄组间IG绝对值和IG百分率检测结果两两比较秩和检验 (n=200)

2. 性别间结果比较 男女的IG计数绝对值结果的分布情况如下(见图4、图5)。将男、女IG绝对值和百分率分别作秩和检验得出(见表5), P< 0.01, 可知IG参考值范围的确立有性别差异。

图4 766例中男性健康者的IG分布情况(n=383)

图5 766例中女性健康者的IG分布情况(n=383)

表5 性别间IG绝对值及百分率检测结果两两比较秩和检验

3. 实验室参考值范围的确定 根据以上结果分析, 应对健康人分性别不分年龄建立实验室的IG绝对值和IG百分率的参考值范围。Sysmex XE-2100全自动血液分析仪定量检测, IG绝对值:男性95%可信区间为(0, 0.04× 109/L); 女性为(0, 0.02× 109/L)。IG百分率:男性95%可信区间为(0, 0.5%); 女性为(0, 0.4%)。

讨论

Sysmex XE-2100全自动血液分析仪提供IG定量检测是近年来发展起来的一项新技术, 其运用“ IG master"软件, 以可变的最适宜的门控而达到对IG的定量检测。本次检测的批内精密度和批间精密度测试结果均小于仪器的设计指标, 表明该仪器对于检测IG指数有良好的重复性。批内精密度较批间精密度略高, 分析其原因可能为批间精密度评估是用质控标本检测, 质控标本的稳定性较临床标本高, 所以其测定结果间的r更小。

本研究将血液分析仪定量检测IG的结果与手工显微镜镜检结果及流式细胞术检测结果进行了比较, 有较好的一致性, 在本次研究中有13份标本WBC分类变异淋巴细胞大于2%, 8例WBC分类有原始细胞(临床确诊为急性白血病), 其结果与流式细胞检测法比较相关性仍良好, 可知, Sysmex XE-2100全自动血液分析仪检测IG时受其他细胞的影响因素较小。我们检测流式细胞法进行IG检测的结果略高于Sysmex XE-2100全自动血液分析仪, 可能为流式细胞术检测时CD16阴性的成熟粒细胞引起IG结果假性增加[6]。

我们认为在保证仪器性能稳定的前题下, 用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪测定IG指数具有简便、快捷、精密、准确、经济等优点, 可满足临床诊断、治疗及疗效观察的需要, 值得推广应用。

本次研究进行了实验室参考值范围的建立。我们的实验结果显示性别间IG参考值检测结果差异有统计学意义, 所以临床上在参考值范围的确定和检测结果的评价时应考虑性别因素。而各年龄段间的IG检测结果差异无统计学意义, 故在参考范围的确定时可不考虑年龄间差异。将本实验所得IG参考值范围与其他文献比较:有文献报道[7]IG绝对值参考范围无性别差异, IG百分率参考值范围有性别差异。而本实验所得IG绝对值和百分率的参考值范围均有性别差异, 分析原因可能与研究选取的样本量及健康人群的选择有关, 可扩大样本量进行进一步研究。由于各方面原因, 各实验室检测IG的参考值范围可能存在一定差异, 故各实验室应建立本室的参考值。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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