1. 菌种 菌种来源利用2007年浙江省衢化医院从痰液和脓液标本中所分离得到的MRSA共20株,标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

2. 仪器 仪器包括聚合酶链反应(PCR)基因扩增仪(MJ)、电泳仪(北京六一仪器厂)、高速离心机(上海安亭科学仪器有限公司)。

3. 引物 合成于上海英骏生物技术有限公司;10 × buffer, 25 mmol/L MgCl₂,dNTP, Taq酶购于上海promega公司,西班牙琼脂糖购于上海天呈科技有限公司;DL2000 Marker购于天根生化科技有限公司。

4. 新洁尔灭敏感性试验 先将新洁尔灭用蒸馏水稀释成不同浓度(分别为20、40、60、80、100、120、140mg/L),每只试管分装5 mL,加入0.1 mL菌悬液,作用于预定时间,取出0.5 mL分别以加入5 mL PBS(0.03 mmol/L, pH 值7.2)作适当稀释。然后取原液和稀释液0.5mL分别接种平板,倾注融化营养琼脂,至37 ℃温箱18 h观察结果。以新洁尔灭最高稀释度无菌生长为最小抑菌浓度(MIC)。

5. PCR 扩增模板的制备牙签挑取适量纯培养菌落放入1.5 mL离心管中(已预放置10 mmol/L Tris HCl),充分振荡混匀,100 ℃煮沸5 min,然后立即放到冰上,12 000 r/min(离心半径6.0 cm),离心5 min,取上清作为PCR扩增用的模板。

6. 新洁尔灭抗性基因的分子检测 对3种可能的抗性基因qac A/B、smr、mecA分别进行扩增分析,引物采用Primer Premier 5.0进行设计( 表1)。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶电泳成像拍照分析。

表1

表1

表1 3种可能的抗性基因扩增分析 引物名称 序列(5’-3’) 扩增条件和长度 qacA/B CTATGGCAATAGGAGATATGGTAT 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性,30 s,50 ℃退火,30 s, CCACTACAGATTCTTCAGCTACATG 72 ℃延伸,30 s, 35cycles;扩增长度578 bp smr AACGAAACTACGCCGACTATGA 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性,30 s,58 ℃退火,30 s, TGCAACTTGGGCGGGAC 72 ℃延伸,30 s, 35cycles;扩增长度123 bp mecA ATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTGG 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性,30 s,56 ℃退火,30 s, TTATCGGACGTTCAGTCATTTC 72 ℃延伸,30 s, 35cycles;扩增长度169 bp

表1 3种可能的抗性基因扩增分析

1. 新洁尔灭敏感性检测结果 20株对新洁尔灭的MIC分布,7株(35%)MIC为40 mg/L,8株(40%)MIC为60 mg/L,4株(20%)MIC为100 mg/L,1株(5%)MIC为120 mg/L。新洁尔灭MIC≥100 mg/L即属于抗药性菌株^{[ 4]},此结果显示本院的MRSA菌株有25%对新洁尔灭具有抗药性。

2. 新洁尔灭抗性相关基因的检测分析 在MIC≥100 mg/L的4株MRSA中,qacA/B基因除了第4株外,其他均能检测到,smr基因仅在第4株中获得阳性结果,mecA基因在第1和第4株中有阳性;而对于MIC≥120 mg/L的1株MRSA中,3种基因qacA/B、smr和mecA均阳性,说明在新洁尔灭抗性的MRSA中,3种基因在MRSA消毒剂抗性中有一定作用( 图1~3)。

图1

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	图1 qacA/B基因PCR扩增结果分析

图2

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	图2 smr基因PCR扩增结果分析

图3

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	图3 mecA基因PCR扩增结果分析

本实验结果显示,MRSA菌株对新洁尔灭消毒剂具有抗性,而且在20株中有1株抗性非常强,MIC≥120 mg/L,比国内已报道的MRSA对消毒剂的耐受性更强^{[ 5]}。通过对3种抗性基因进行分析,在MIC≥100 mg/L的5株MRSA中,qacA/B基因在4株中高水平表达,说明qacA/B在耐消毒剂中起主导作用,这可能与qacA/B基因表达的大量外排泵蛋白相关,但是QacA蛋白还是QacB蛋白还需要进一步测序才能确定。qacA/B基因对消毒剂的抗性机制和国内外的一些报道相符^{[ 3]}。对于smr基因主要造成低程度的抗药性,本实验中有2株MRSA表达smr基因,但在没有qacA/B表达的第4号MRSA中,通过表达Smr和MecA 2种抗性蛋白来实现对消毒剂的抗性,这说明不仅qacA/B在MRSA抗消毒剂中起主导作用,而且smr或MecA基因的表达也可MRSA表现较强的消毒剂抗性。在1株MIC≥120 mg/L的MRSA菌株中,3种基因qacA/B、smr和mecA均阳性,可能是3种基因共同发挥作用来实现其高的消毒剂抗性。

MRSA耐消毒剂基因qacA/B、smr和mecA的联合检测,能筛选出抗消毒剂MRSA的菌株,从而有效指导消毒剂的使用剂量和方法,避免多重耐药菌株的流行和传播。