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朱均昊 综述, 章强强 审校. 男性尿道炎及其相关病原菌实验诊断进展. 25(2): 150-154
  
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男性尿道炎及其相关病原菌实验诊断进展
朱均昊 综述, 章强强 审校
复旦大学附属华山医院皮肤科,上海 200040

通讯作者：章强强,联系电话：021-52887776。

作者简介：朱均昊,男,1985年生,学士,技师,主要从事医学真菌及性传播性疾病的实验室研究。

关键词: 尿道炎; 沙眼衣原体; 生殖器支原体; 阴道毛滴虫
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)02-0150-05

男性尿道炎是一种尿道炎症,通常伴随有排尿困难和尿道分泌物。广义来说,尿道炎被归类为性传播性疾病(sexually transmitted diseases,STDs)。尿道炎可以被分为2组:淋球菌性尿道炎(gonorrhea urethritis, GU),由淋病奈瑟菌所引起;非淋球菌性尿道炎(nongonococcal urethritis,NGU),目前在欧美国家的发病率已超过了GU,沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis,Ct)是其最常见的病原体,NGU中30%~50%的病例由Ct感染引起;解脲脲原体( Ureaplasma urealyticum,Uu)和生殖器支原体( Mycoplasma genitalium,Mg)的感染占到了10%~20%[ 1],还有约1%~17%的病例由阴道毛滴虫( Trichomonas vaginalis)引起,少于10%的病例与白念珠菌、嗜血杆菌(属)、链球菌属和阴道加德纳菌等有关,但仍有20%~50%病例的病原体没有得到鉴别,因此也称为“非特异性生殖道感染”。我们结合国内外文献对男性尿道炎主要致病菌的实验室诊断及其最新进展作一综述。

一、GU的实验室诊断

1. 淋病奈瑟菌涂片检查 取患者分泌物涂片作革兰染色镜检,可见在多形核白细胞内革兰阴性的双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯性淋球菌性前尿道炎的患者具有初步诊断意义,敏感性及特异性达90%以上,具有快速、简便的优点。

2. 淋病奈瑟菌分离培养与鉴定 由于淋病奈瑟菌对培养的营养要求较高,在含有动物蛋白的培养基中方能生长良好。Thayer-Martin(TM)培养基能使绝大多数杂菌被抑制而淋病奈瑟菌生长良好,在平板上几乎呈纯培养,从而明显提高淋病奈瑟菌分离的阳性率。在Bhalla等[ 2]的实验中,男性尿道炎患者脓液标本培养的检出率为70%,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的阳性率为77%。

3. 免疫学检测方法 目前有酶联免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)和直接荧光抗体(direct immunofluorescenee assay,DIFA)染色方法,主要应用多克隆或单克隆抗体,通过抗原-抗体的特异性结合,直接检测临床标本中淋病奈瑟菌抗原,为诊断GU提供了快速、简便的方法。EIA诊断男性GU的敏感性为83%~96%,特异性为96%~100%,DIFA与EIA在敏感性及特异性方面相近,但需高质量的荧光显微镜,判定结果受检查者的主观因素影响较大。

二、衣原体性尿道炎的实验室诊断

1. 细胞分离培养 组织细胞培养法分离Ct多采用将标本接种入单层的McCoy细胞或Hela 229细胞,经孵育后作吉姆萨、碘液或单克隆抗体荧光染色,高倍或荧光显微镜下观察包涵体。细胞培养凭借其高度的特异性以往一直是诊断Ct感染的“金标准”,但其耗时长、费用高、易污染,对培养技术要求高,实际上在临床上已被核酸扩增技术及抗原测定技术所代替。

2. DIFA 根据Ct主要外膜蛋白或脂多糖的单克隆抗体可与相应的抗原结合,用荧光标记Ct的单克隆抗体,此抗体与标本中的Ct结合后,荧光显微镜检查可见具荧光的Ct。该方法诊断Ct的敏感性为70%~95%,特异性为83%~99%,优点是快速、简便、成本低廉,缺点是敏感性较差,不适合较大人群的筛选,且受实验操作人员主观因素影响较大。

3. 抗原抗体免疫检测法 Ct快速免疫(C-C)法是利用Ct属特异性脂多糖抗原单克隆抗体的测定来检测Ct,已有商品化试剂盒,其具有操作简便、报告快捷,并可就单一标本立即检测,适用于一般门诊检查的优点。该法特异性好,与细胞培养法比较可达100.0%,但其阳性检出率相对较低,需要标本中有足够数量的抗原,其敏感性低于细胞培养法和PCR。取材方法的不同,对C-C法的测定结果有着不同的影响。自动酶联免疫荧光法(VIDAS)用一种鼠抗Ct脂多糖抗原的单克隆抗体,一种标记有碱性磷酸酶的免疫球蛋白和荧光底物,整个测试反应均在多参数免疫分析仪内自动进行,避免了污染,也消除了许多偶然误差,结果更客观。与细胞培养法相比,其敏感性和特异性分别为97.6%和96.7%,是一种较为可靠的检测方法。VIDAS的另一个优点是可检测尿液中的Ct,既减轻了患者的痛苦,又特别适合大量标本的筛查。EIA用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测Ct的脂多糖或主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP),酶反应生成有色产物,用酶标仪进行测定,其特异性较高,但敏感性波动较大。多聚体结合增强酶联免疫测定(polymer conjugateenhanced enzyme immunoassay,IDEIA PCE)的出现弥补了该缺点,他是一种检测Ct脂多糖的双重扩增免疫测定方法,其利用属特异的Ct单克隆抗体及酶免信号放大系统来检测Ct抗原,经过2次酶免信号放大,其敏感性及特异性接近PCR[ 3]。

4. 核酸扩增试验(nucleic acid amplification testing,NAAT) NAAT是对Ct的靶序列进行特异性扩增,即使只有1个病原体仍能检出,可见该试验对Ct具有高度的敏感性。PCR检测Ct扩增的靶序列主要有3种:MOMP、隐蔽性质粒基因及rRNA基因。三者的敏感性中隐蔽性质粒基因最高。荧光定量PCR(FQ-PCR)是目前应用比较广泛的PCR检测Ct技术,他结合了PCR的核酸高效扩增、基因扩增的敏感性、分子杂交的特异性和光谱技术的敏感性及精确定量的特点,从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题,结果判断客观、真实,定量范围宽(可包括0~108拷贝/μL)。Bhalla 等[ 2]的实验中,DIFA与PCR的检出率分别为7.5%和17.5%,但他们也发现试验中存在PCR阳性但培养/DIFA阴性或PCR阴性而培养/DIFA阳性的情况。因此,目前认为单独的PCR试验不可用来诊断Ct感染。连接酶链反应 (ligase chain reaction,LCR)是在PCR基础上发展起来的一种新的核酸扩增技术,要求有2对引物、DNA 聚合酶和热稳定DNA 连接酶参与反应,其特异性是引物所固有的,2对引物接头处与靶DNA链之间即使有一个碱基错配也不能被连接和扩增,所以只要操作严格,可避免假阳性的出现[ 2]。有报道认为LCR 诊断Ct的特异性可达95.0%~99.9%,同时其敏感性也可达到95.0%以上[ 4]。LCR的优点:适用于女性宫颈拭子、男性尿道拭子、晨尿等标本,均可检测出Ct DNA,尤其可从尿标本中检测出衣原体[ 5],这一非侵袭性的诊断方法使得对无症状人群进行普查成为可能,而且检测时间更短。

三、支原体性尿道炎的实验室诊断

在Mg被分离出之前,支原体性尿道炎一直被归因于Uu和人型支原体( Mycoplasma hominis,Mh)。而近年来随着诊断技术的改进和提高,在NGU中,不断有报道发现Mg是NGU的重要病原体[ 6]。男性NGU患者中Mg的检出率高于无症状者。Maeda 等[ 7]的研究结果显示,在被检的男性尿道炎患者中Mg、Uu、微小支原体和Mh分别占到了17.0%、16.3%、7.8%和2.6% 。 Leung等[ 8]通过研究发现,男性尿道炎患者如果有尿道异常分泌物或排尿刺激症,则比起无症状者有更大概率患有Mg感染。

1. Uu的实验室诊断 (1)分离培养方法:Uu在含95%氮气和5%CO2环境中生长良好。在Uu固体培养基上,能生长成具特征性油煎蛋样集落。Uu含有尿素酶,分解尿素产氨,使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升,颜色由黄色变为红色。代谢抑制试验和生长抑制试验根据特异性抗体能阻止支原体生长和代谢这一特性,可用患者血清进行试验。在加有抗血清的培养基中,支原体的代谢受到抑制,从而阻止了培养基的颜色改变。生长抑制试验通过观察加抗血清的滤纸周围的情况判断种群。间接血凝试验用经鞣酸处理的红细胞作载体,通过表面吸附抗原致敏红细胞,待与相应的血清抗体相遇时,可出现肉眼可见的凝集现象;(2)分子生物学方法:采用 PCR及DNA探针技术检测支原体,PCR具有高度的特异性和敏感性,并且快速、简便,但操作条件及要求非常严格。Uu引物的选择是PCR 检测技术中的关键, 一般以Uu的16sRNA、脲酶基因、MB抗原基因为靶基因。目前,此技术难以在临床上作为常规检测开展,而DNA探针相对敏感性较差。

2. Mh的实验室诊断 Mh在有氧及无氧环境中均能生长,在液体培养基中培养2~3 d、固体培养基上培养4~5 d即可生长成集落。生长条件除需胆固醇外,尚需要精氨酸。Mh具有精氨酸脱氢酶,能水解精氨酸产氨,使含酚红指示剂的Mh液体培养基pH值上升,呈碱性,颜色由橙黄色变为红色。Mh和Uu一样,不发酵葡萄糖,这与Mg有区别。培养基中不加尿素,需加入精氨酸,其他营养成分与Uu相同。Mh的其他实验诊断方法与Uu相同。

3. Mg的实验室诊断 Mg在1980年首次通过改良支原体液体培养基(SP-4)从男性NGU患者中检出,但其生长极其缓慢,需要超过50 d以上的时间来观察培养基颜色的改变。组织细胞培养支原体,可为支原体提供良好的类似体内的生长环境。Jensen等[ 9]首次用Vero细胞分离培养Mg,从11份PCR检测Mg DNA阳性的标本中分离出4株Mg。通过研究表明,在用Vero细胞分离的情况下,使用胎小牛血清效果会更好。细胞培养法较之传统培养基的方法更为高效,但依旧费时,产物需要通过PCR进一步鉴定,需长达几个月的多次移种来确保菌株的纯化,且有些菌株只有过滤后才能在液体培养基上生长。

Mg和肺炎支原体的抗原之间存在的交叉性,阻碍了其血清学诊断方法的应用。酶联免疫吸附试验(ELISA)提取支原体表面的脂结合膜蛋白(lipid-associated membrane protein,LAMP),利用其支原体种属特异性抗原,且不同支原体的LAMP抗体具有高度种属特异性,与其他种属无交叉反应,建立ELISA检测Mg抗体,可消除Mg与肺炎支原体之间的交叉反应。有学者应用该方法检测104例患者,其中40例(38%)为LAMP ELISA 阳性,在这些阳性标本中又有15例(38%)尿标本的PCR检测结果为阳性,所有阳性患者都得到确认。LAMP ELISA成为最有希望应用于男性尿道炎患者的血清学方法之一[ 10]。此外,国外有实验尝试通过免疫印迹法检测Mg的MaPa片段,以达到检出Mg的目的[ 11]。

在PCR发展之前,DNA探针技术被尝试用于研究人感染的Mg,通过设计针对16rRNA的放射标记的寡核苷酸探针,可以检测最低限为103cfu,并且可以特定检测Mg。探针技术克服了Mg培养费时、费力、阳性率低等弊端,也解决了Mg在血清学上与肺炎支原体产生交叉反应的问题,PCR扩增的靶基因主要为Mg的表面抗原MgPa基因和16sRNA基因。Jensen等[ 12]的研究认为,MgPa片段序列在Mg的各株间有明显的异质性,主要表现为碱基插入突变,即某些限制性酶切位点的缺如,而不同来源的Mg 16sRNA区域PCR产物序列分析其同源性为100% ,故16sRNA引物用于研究人群中Mg的感染情况更合适,Jensen等设计的16sRNA引物为Mg-15和Mg-25。最近,Yoshida等[ 6]建立了以Mg 16sRNA基因为靶基因的FQ-PCR,是培养法及其他非培养法均不能定量检测Mg,而FQ-PCR可在107~1010拷贝/反应的范围内测出Mg 16sRNA基因量,但其操作复杂,成本较高。而Edberg 等[ 13]通过实验比较,发现实时MgPa基因PCR有着比传统16sRNA基因PCR更高的敏感性,与实时16sRNA基因相比在检出Mg DNA上敏感性也有很大的提高,他们认为实时MgPa基因PCR可能更适合临床诊断Mg。

四、毛滴虫性尿道炎的实验室诊断

随着检测技术的提高,阴道毛滴虫在男性尿道分泌物中的检出率不断上升,因其高致病性已成为男性NGU中重要的病原体[ 14],并有研究表明阴道毛滴虫与男性前列腺癌和不孕也有关联[ 15]。

1. 镜检与培养法 湿片镜检是一种简便有效、适合常规诊断的技术,但是检出率低,阳性率仅50%~70%。因为阴道毛滴虫离体后常受环境的影响,很快失去活力,难以辨认,故在取得标本后应尽快进行检查,以免漏诊。培养法习惯上被认为是诊断阴道毛滴虫病的金标准[ 16],而InPouch-TV培养基是目前一种敏感性较高的阴道毛滴虫专用培养基,具有多方面的优点: (1)敏感性较高,每毫升培养基中含4个微生物即可被检测到;(2)具有抗多种细菌和真菌能力;(3)贮存时间较长,室温下可保存1年;(4)适合转运;(5)操作简便,易于镜检。但培养法对正在药物治疗的患者标本不易检出,而且培养法时间长,难以普及,有尿道炎症状的男性患者的短期培养阳性率要远高于无症状的患者[ 17]。

2. 免疫检测法 国外研究表明,ELISA检测阴道毛滴虫敏感性好(95.0 %),特异性高(99.4 %),但在诊断中常用可溶性抗原,操作繁琐,无标准化抗原,具有一定局限性。最近用阴道毛滴虫全虫抗原进行斑点ELISA(dot-ELISA),操作简便,不需特殊仪器,有望成为新的免疫学诊断方法。Kaydos-Daniels等[ 18]认为对于临床试验尿道拭子取材不理想,培养法的可行性较差的标本,基于尿液的PCR或ELISA或许能够更有效的监测男性患者的阴道毛滴虫。

3. 分子生物学方法 1992年PCR首次被用于检测阴道毛滴虫,选择阴道毛滴虫的铁氧化还原蛋白基因(ferredoxin gene)作为靶基因,其引物为TVA5和TVA6。此后,又有多种针对不同特异序列的引物被引用,如BTUB9-BTUB2、AP65A-AP65B及TVK3-TVK7等,但尚无资料对各种引物进行系统地比较。PCR检测阴道毛滴虫具有较高的敏感性和特异性,Lawing等[ 16]认为对于诊断男性滴虫感染,PCR可能优于分离培养法。Hobbs等[ 17]的实验证实了这一点,PCR的检出率(98.0%)远高于InPouch-TV 培养法(22.5%),不过即便依赖敏感的PCR,诊断阴道毛滴虫仍然希望能够获得男性患者的多种标本以提高准确率。

五、男性念珠菌性尿道炎的实验室诊断

随着近年来广泛应用广谱抗菌药物及皮质激素,男性念珠菌性尿道炎的发病率日趋上升,有文献报道男性NGU中念珠菌的检出率为4.4%~21.0%不等,显示该病最主要的致病菌是白念珠菌。男性念珠菌性尿道炎多数是从女性念珠菌性阴道炎接触传染而发病,念珠菌感染也可以发生在男性外生殖器,引起念珠菌性龟头炎。

1. 涂片镜检 男性刮取阴茎龟头、冠状沟或包皮处皮损表面鳞屑作为待检标本。取少许待检标本制片,于显微镜下寻找孢子和菌丝。如找到较多的菌丝,说明念珠菌处于致病阶段,对诊断更有意义。用这种方法诊断的准确率为50%~70%,阴性结果不能排除本病。

2. 分离培养与鉴定 真菌培养主要使用沙氏葡萄糖琼脂培养基,接种标本后孵育48 h观察结果,对培养阳性者再作进一步菌种鉴定。将初代分离的真菌接种于含有科玛嘉念珠菌显色培养基的平皿上,经过37 ℃ 24~48 h的培养,观察菌落的显色反应,有4种念珠菌可以得到鉴定:翠绿色菌落者为白念珠菌;蓝灰色者为热带念珠菌;紫红色、边缘模糊有微毛者为克柔念珠菌;菌落中央呈紫红色者为光滑念珠菌。

由法国生物梅里埃公司提供的API 20C AUX真菌鉴定系统是目前快速鉴定真菌的一种较理想的方法。其由19个生化测定干粉底物的20个小杯所组成,小杯内含半固体微量培养基供接种,只有能以该底物为惟一碳源的真菌才能生长。判读反应后结果转为7位数的生物型编码,通过查阅编码手册得出鉴定结果。大多数真菌48 h内可得到鉴定,新生隐球菌和毛孢子菌则需72 h。

六、小结

男性尿道炎致病原因较为复杂。随着近年来分子生物学、免疫学的发展以及PCR、LCR在实验室中的广泛应用,这些非传统培养的方法不仅丰富了主要致病菌的检测手段,还提高了Mg、阴道毛滴虫等培养困难的致病菌的检出率,为疾病的诊断及预后的监测提供了有益的帮助。

The authors have declared that no competing interests exist.

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