引用本文
朱丰村, 周丽萍. 穿通支原体感染对肿瘤浸润及转移的影响. 25(2): 113-117
ZHU Fengcun, ZHOU Liping. The effect ofMycoplasma penetrans infection on tissue infiltration and metastasis of tumor . Labratory Medicine, 25(2): 113-117  
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《检验医学》编辑部
穿通支原体感染对肿瘤浸润及转移的影响
朱丰村, 周丽萍
温州医学院检验学院,浙江 温州 325003

通讯作者：周丽萍, 联系电话：0577-88069589。

作者简介：朱丰村,男,1978年生,学士,主管技师,主要从事临床免疫和分子生物学检验工作。

摘要
目的

探讨穿通支原体(Mpe)感染对肿瘤浸润和转移的影响。

方法

收集53例膀胱移行细胞癌(TCCB)和40例直肠癌患者的手术切除组织标本和血液标本;以34例前列腺炎、膀胱炎及前列腺增生患者,21例直肠息肉患者的组织标本和血液标本及44名健康体检者血液标本作为对照。192例研究对象(共340份标本)分别进行Mpe分离培养鉴定,可疑阳性及阳性菌株用聚合酶链反应(PCR)予以核实。

结果

TCCB组Mpe累积分离率(43.4%,23/53)与前列腺炎组(17.6%,6/34)比较,差异有统计学意义(P<0.05);直肠癌组Mpe累积分离率(70.0%,28/40)与直肠息肉组 (4.8%,1/21)比较,差异有统计学意义 (P<0.01);肿瘤组Mpe总累积分离率 (54.8%,51/93)与健康体检组 (0.0%,0/44 )比较,差异有统计学意义(P<0.01);Mpe 阳性TCCB组组织浸润检出率与Mpe阴性组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Mpe阳性直肠癌组组织浸润检出率与Mpe阴性组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Mpe阳性直肠癌组淋巴结转移检出率与Mpe阴性组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

结论

穿通支原体感染与肿瘤组织浸润以及转移相关联。

关键词: 穿通支原体; 肿瘤; 组织浸润; 淋巴结转移
中图分类号:R375 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)02-0113-05
The effect ofMycoplasma penetrans infection on tissue infiltration and metastasis of tumor
ZHU Fengcun, ZHOU Liping
School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College, Zhejiang Wenzhou 325003, China
Abstract
Objective

To investigate the infection ofMycoplasma penetrans(Mpe) in patients with transitional cell carcinoma of bladder (TCCB) and patients with rectal carcinoma, and find out their relationship with tissue infiltration and metastasis of the tumor.

Methods

Blood and tissue specimens were collected from 93 carcinoma patients, including 53 cases of TCCB and 40 cases of rectal carcinoma. Meanwhile, there were 34 patients with prostatitis, cystitis and hyperplasia of prostate gland and 21patients with proctopolypus and 44 healthy subjects were performed as controls. The Mpe were isolated and cultured from these samples (total: 192 cases and 340 specimens) and the positive and suspected-positive isolates were confirmed by nested polymerase chain reaction(nPCR).

Results

The rate of Mpe in TCCB group(43.4%,23/53)was significantly higher than that in the prostatitis group(17.6%, 6/34,P<0.05), and the rate in the rectal carcinoma group(70.0%,28/40)was also significantly higher than that in the proctopolypus group(4.8%, 1/21,P<0.01). The total positive rate of Mpe (54.8%,51/93) in tumor cases was significantly higher than that in the control group (0.0%, 0/44,P<0.01). The detected rate of tissue infiltration in the Mpe infection group was significantly higher than that in non-infection group (P<0.05). The detected rate of lymphatic metastasis of rectal carcinoma patients in Mpe infection group was significantly higher than that in non-infection group (P<0.05).

Conclusions

The result suggests that the tissue infiltration and metastasis of TCCB and rectal carcinoma are correlated to Mpe infection.

Keyword: Mycoplasma penetrans; Tumor; Tissue infiltration; Lymphatic metastasis

穿通支原体( Mycoplasma penetrans,Mpe)是近年来新发现的致病性支原体[ 1, 2]。Lo等[ 1]1992年首次报道从感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的男性同性恋患者尿中分离到Mpe。近年来认为Mpe具有促使HIV体内复制,加快HIV感染者获得性免疫缺陷综合征(AIDS)发病进程的作用,故称为AIDS协同因子[ 3]。Tsai等[ 4]和Zhang等[ 5]报道Mpe感染小鼠胚胎C3H细胞先引起正常细胞发生可逆性转化,直至呈不可逆性恶性转化。2006年我们曾报道膀胱移行细胞癌(TCCB)、胃癌、直肠癌以及宫颈癌患者血液和肿瘤组织中Mpe的检出率显著高于非肿瘤患者[ 6, 7],为进一步证实Mpe感染对TCCB和直肠癌组织浸润及其淋巴结转移的影响,本研究对温州医学院附属第一医院93例肿瘤患者进行Mpe分离鉴定,并进行组织浸润和淋巴结转移分析,试图探讨Mpe感染与TCCB和直肠癌浸润、转移之间的关系。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象与分组 肿瘤组93例患者(HIV抗体阴性)来自2008年2至12月温州医学院附属第一医院,其中包括TCCB 53例,直肠癌40例,年龄 28~83岁。对照组99例,包括前列腺炎组(前列腺炎、前列腺增生和膀胱炎)34例,直肠息肉组21例以及健康体检者44名。共192例研究对象,收集340份组织及血液标本。所有病例均经病理检查证实,标本取材前均未行化疗、放疗或抗菌药物等特殊治疗。各组间年龄差异无统计学意义。随机选取经套式聚合酶链反应(nPCR)证实为Mpe感染的TCCB患者血液Mpe纯培养物及直肠癌组织标本各1例进行电镜观察,并对所有患者的肿瘤组织病理切片进行组织浸润程度和淋巴结转移分析。

2. 标准菌株和培养基 标准菌株Mpe(ATCC 55252)、发酵支原体(Mf,ATCC 19989)、猪鼻支原体(Mhy, ATCC 17981)、肺炎支原体(Mp,ATCC 15531)、解脲脲原体(Uu,ATCC 27618)及人型支原体(Mh, ATCC 23114)分别由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠。改良支原体液体培养基(SP-4)用于Mpe、Mf和Mp的分离培养;Uu和Mh液体培养基以及生化试验培养基制备见文献[ 6, 7]。

3. 试剂与仪器 Mpe、Mf 和Mhy PCR试剂购自江苏无锡遗传研究所。RMC-PT超薄切片机由温州医学院电镜室提供。

二、方法

1. 标本的采集与处理 血液和组织标本的预处理见文献[ 6]。患者的组织标本分作3份,一份制成细胞悬液后用0.3 μm滤膜过滤除菌,取滤液0.2 mL分别接种于改良SP-4支原体培养基、Uu和Mh液体培养基;一份用福尔马林固定后送病理切片室作常规检查;另一份作常规电镜标本,置4 ℃冰箱备用。患者和正常人血清0.2 mL分别接种于改良SP-4支原体培养基、Uu和Mh液体培养基。

2. Mpe的分离培养与鉴定 阳性液体培养物转种至固体培养基,初步鉴定菌株经生化初筛后采用Mpe、Mf和Mhy PCR核实,确认为检出特异Mpe DNA。

3. 电镜观察 取分离自TCCB患者血液并经nPCR 证实为Mpe阳性的菌株进行负染技术处理,H-7500透射电镜下观察、拍片。并取经nPCR 证实为Mpe的直肠癌患者肿瘤组织,经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定,丙酮梯度脱水,Epon-812环氧树脂包埋,RMC-PT超薄切片机切片,半薄切片光镜定位于癌组织实质细胞部分,超薄切片经铅-铀双重染色,H-7500透射电镜下观察、拍片。

4. Mpe感染与TCCB和直肠癌组织浸润、转移分析 分别对Mpe检出阳性和阴性肿瘤组的病理切片结果进行组织浸润程度及淋巴结转移分析。

三、统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件。肿瘤组和非肿瘤组Mpe累积分离率以及Mpe检出阳性和阴性肿瘤患者组织浸润、淋巴结转移等比较采用 χ2检验以及 χ2校正检验。

结果
一、Mpe的鉴定

192例研究对象共340份血液与组织标本接种改良SP-4支原体液体培养基、Uu和Mh液体培养基。未检测到Mh和Uu。对其中148例研究对象的296份血液与组织标本中59例(90份)培养可疑阳性菌株进行过滤除菌,并在血平板上转种排除L型细菌。然后转种至支原体改良SP-4固体培养基,58例(89份)标本见油煎蛋样菌落,见 图1;初代培养阳性的培养液经0.3 μm滤膜过滤后,同时转种于葡萄糖、精氨酸、尿素生化反应培养基,置5%CO2 37 ℃条件下培养2~3 d,与标准菌株作对照,经初步鉴定,发现该89份标本分解葡萄糖和精氨酸,不分解尿素,可排除Mp(不分解精氨酸)和Uu(分解尿素)。但因Mf和Mpe均能分解葡萄糖和精氨酸,因此以nPCR鉴别。 经nPCR扩增、电泳后可见其扩增条带,见 图2;随机选取其中1例经上海生工Mpe DNA 核酸序列测定并与数据库已知Mpe菌株HF-2[ 6, 7]比对,结果一致。

图1 固体培养基Mpe油煎蛋样菌落(×400)

图2 分离自TCCB和直肠癌患者血液或组织标本阳性培养物Mpe PCR扩增产物电泳图

二、患者血液与组织中Mpe的检出

53例TCCB患者的组织和血液标本中共分离到35株Mpe,其中12例组织和血液标本同时分离到Mpe,9例组织标本和2例血液标本分别分离到Mpe,Mpe感染阳性23例(35株Mpe);40例直肠癌患者的组织和血液标本中共分离到44株Mpe,其中16例组织和血液标本同时分离到Mpe,11例组织标本和1例血液标本分别分离到Mpe,Mpe感染阳性28例(44株Mpe);34例前列腺炎组患者的组织和血液标本中共分离到9株Mpe,其中3例组织和血液标本同时分离到Mpe,2例组织标本和1例血液标本分别分离到Mpe,Mpe感染阳性6例(9株Mpe);21例直肠息肉患者的组织和血液标本中共分离到1株Mpe,即1例组织标本分离到Mpe,Mpe感染阳性1例(1株Mpe)。

TCCB组Mpe累积分离率(43.4%,23/53)与前列腺炎组(17.6%,6/34)比较,差异具有统计学意义( χ2=6.180, P<0.05);直肠癌组Mpe累积分离率(70.0%,28/40)与直肠息肉组 (4.8%,1/21)比较,差异具有统计学意义( χ2=23.50, P<0.01);93例肿瘤患者Mpe总累积分离率(54.8%,51/93)与55例非肿瘤患者组 (12.7%,7/55)比较,差异有统计学意义( χ2=25.718, P<0.01);肿瘤组Mpe总累积分离率(54.8%,51/93)与健康体检组(0.0%,0/44)比较,差异有统计学意义( χ2=38.438, P<0.01),见 表1。

表1 肿瘤组、非肿瘤患者组和对照组标本中Mpe分离结果
三、其他支原体的检出

本研究中患者血液和组织标本中未检出Mf、Mp、Uu、Mh和Mhy。

四、电镜观察结果

分离自Mpe nPCR阳性的TCCB患者血清纯培养物经负染电镜观察,发现具有完整包膜棒槌状结构Mpe颗粒,见 图3a。Mpe培养阳性并经nPCR证实的直肠癌组织电镜观察,发现肿瘤细胞排列紊乱,形成腺腔样结构,基膜不完整,有的完全缺如,可见微小浸润现象,细胞质内靠近游离面有多少不等的黏液颗粒,有的融合成湖状,内质网空泡变性;受感染的细胞,其膜性细胞器均存在不同程度的空泡变性、溶解坏死,肿瘤组织间质中胶原纤维排列较乱。肿瘤组织中见三层膜结构的Mpe颗粒,见 图3b。

图3 Mpe阳性血液纯培养物与组织的电镜观察

五、Mpe感染与TCCB和直肠癌组织浸润、淋巴结转移分析

根据Mpe感染阳性或阴性将TCCB患者、直肠癌患者分别分为2组。所有肿瘤病例均通过病理活检确诊,具有明确的病理报告,并根据病理UICC-TNM标准分期。对53例TCCB患者的手术切除组织标本作病理检测分析,发现Mpe阳性组组织浸润(≥T1)检出率(43.5%,10/23)与Mpe阴性组(16.7%,5/30)比较,差异具有统计学意义( χ2=4.612, P<0.05),见 表2。对40例直肠癌患者的手术切除组织标本作病理检测分析,发现Mpe阳性组组织浸透浅肌层(≥T2b)检出率(92.9%,26/28)与Mpe阴性组(58.3%,7/12)比较,差异具有统计学意义( χ2=4.750, P<0.05);Mpe阳性组淋巴结转移检出率(67.9%,19/28)与Mpe阴性组(25.0%,3/12)比较,差异具有统计学意义( χ2=6.234, P<0.05),见 表3。

表2 TCCB患者Mpe感染与肿瘤组织浸润
表3 直肠癌患者Mpe感染与组织浸润及淋巴结转移
讨论

肿瘤的发生是一个多因素参与的复杂过程。近年来的研究提示支原体与肿瘤的发生存在某种关联,尤其是Mpe。因为细胞体外培养和动物实验都已证实Mf、Mpe具有转化以及致癌潜能[ 8]。进一步的研究发现,Mpe是通过其纤维连接素结合蛋白(65 000)选择性固定于宿主细胞膜纤维连接蛋白(145 000)上,并与该蛋白的酪氨酸磷酸化有关[ 9]。还有报道,Mpe或Mf以及Mhy导致宿主细胞发生转化,与病毒的致癌机制不同[ 4, 5, 9]。

本研究通过分离培养及PCR核实,从93例非HIV感染肿瘤患者血液及组织标本中检出51例Mpe阳性(79株Mpe),累积分离率为54.8%,与非肿瘤患者组(12.7%,7/55)比较,差异有统计学意义( P<0.01)。而健康体检组中无1例阳性(0.0%,0/44)。此结果支持Mpe感染与消化道、泌尿生殖道肿瘤的发生密切相关。

为进一步探讨Mpe感染与肿瘤浸润、转移之间的关系,本研究将53例TCCB患者和40例直肠癌患者手术切除组织标本分别进行组织浸润程度和淋巴结转移分析,与Mpe感染阴性肿瘤组相比,感染了Mpe的肿瘤组织似乎具有更强的浸润和淋巴结转移能力( P<0.05)。有报道,Mpe的持续感染可导致内皮细胞增生及大量血管内皮细胞生长因子等介质的产生,这一方面直接促进肿瘤细胞的增生;另一方面增加血管通透性,使肿瘤细胞容易进入微血管及穿透其邻近的基质和结缔组织包膜,从而促进肿瘤的浸润和转移[ 10~ 12]。Ilantzis等[ 13]和Ushio等[ 14]也曾相继报道感染了支原体的细胞比未感染支原体的细胞在体内有更强的转移能力。

肿瘤的侵袭转移要经历一个长期、复杂的过程,要证实Mpe感染的确参与其中,有必要建立相关的肿瘤细胞模型及动物原位癌模型,同时进行Mpe接种及定植等研究,以观察肿瘤生长、浸润和转移情况。此外,在Mpe体内寻找与之相关的基因或免疫活性蛋白等尚待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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