引用本文
刘淑会, 付秀红, 齐子芳. 心肌梗死患者对氧磷酶-1 Q/R192基因多态性及活性检测的临床意义[J].检验医学, 2015,25(12): 965-967
LIU Shuhui, FU Xiuhong, QI Zifang. Clinical significance of detecting Q/R192 polymorphism of the paraoxonase-1 gene and its activity in patients with acute myocardial infarction[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 965-967  
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心肌梗死患者对氧磷酶-1 Q/R192基因多态性及活性检测的临床意义
刘淑会, 付秀红, 齐子芳
泰山医学院附属聊城市第二人民医院,山东 临清 252600

作者简介:刘淑会,女,1974年生,学士,技师,主要从事临床生化检验工作。

摘要
目的 探讨心肌梗死(AMI)患者对氧磷酶-1(PON1) Q/R192基因多态性及其活性检测的临床意义。方法 分别采用紫外线分光光度法和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)法检测65例AMI患者和70名健康体检者PON1活性及PON1Q/R192基因多态性。结果 AMI组血清PON1活性[(78.56±16.69)U/mL]明显低于健康对照组[(118.65±30.25)U/mL]( P<0.01)。AMI组与健康对照组3种基因型及2种等位基因频率分布差异无统计学意义( P>0.05);AMI组与健康对照组间不同PON1 Q/R192基因型间血清PON1活性相比差异有统计学意义( P<0.01);AMI组内及健康对照组内PON1 Q/R192不同基因型间血清PON1活性相比差异无统计学意义( P>0.05)。结论 血清PON1活性降低是AMI的危险因素之一;PON1Q/R192基因多态性与AMI的发生无相关性。
关键词: 对氧磷酶-1; 心肌梗死; 基因多态性
中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0965-03
Clinical significance of detecting Q/R192 polymorphism of the paraoxonase-1 gene and its activity in patients with acute myocardial infarction
LIU Shuhui, FU Xiuhong, QI Zifang
Liaocheng Second People's Hospital, Taishan Medical University,Shandong Linqing 252600,China
Abstract
Objective To study the clinical significance of Q/R192 polymorphism of the paraoxonase-1 ( PON1) gene and its activity in patients with acute myocardial infarction (AMI).Methods PON1 activity was detected by ultraviolet spectrophotometry, and the Q/R192 polymorphism of the PON 1 gene was determined by polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RELP) in 65 patients with AMI and 70 healthy controls.Results Serum PON1 activity [(78.56 ± 16.69) U/mL] in AMI patients was significantly lower than that in healthy controls [(118.65 ± 30.25) U/mL]( P<0.01). The frequency distribution of 3 genotypes and 2 alleles had no significant difference ( P>0.05). The serum PON1 activity of different PON1 Q/R192 genotypes was significantly different between AMI patients and healthy controls ( P<0.01). The serum PON1 activity of different PON1 Q/R192 genotypes had no statistically significant difference in the groups of AMI patients and healthy controls( P> 0.05).Conclusions The decrease of serum PON1 activity is one of the risk factors for AMI. PON1Q/R192 gene polymorphism has no correlation with AMI.
Keyword: Paraoxonase-1; Acute myocardial infarction; Gene polymorphism

对氧磷酶(paraoxonase, PON)家族是由PON1、PON2、PON3组成的。三者在分子结构、基因结构及生物学特性上都有很多相似性。近年来的研究发现, PON1具有抗低密度脂蛋白(LDL)氧化作用, 在抑制慢性心血管疾病的发生发展中发挥重要作用[1]。目前对PON1活性及其基因多态性与心血管疾病关系的研究日益重视。我们通过观察急性心肌梗死(AMI)患者血清PON1 Q/R192基因多态性及活性, 探讨PON1在AMI发生发展中的临床价值。

材料和方法
一、研究对象

选择2008年3月至2009年6月泰山医学院附属聊城市第二人民医院心内科确诊的AMI急性期患者65例, 男43例, 女22例, 年龄32~68岁, 全部符合临床诊断标准[2]。同期选择临清市医院体检中心健康体检者70名作为对照组, 男42名, 女28名, 年龄35~71岁。AMI急性期患者和对照组均无呼吸系统疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。

二、试剂和仪器

1.试剂 TaqDNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷(dNTPs)(美国Promega公司), AiwI限制性内切酶(英国NEB公司), 基因组DNA抽提试剂盒(美国Promega公司), 引物 (上海生工)。

2.仪器 美国Bio-Rad PE2400聚合酶链反应(PCR)仪; 德国 Herolab UVT-28凝胶成像系统; DYY-7B型电泳仪(北京市六一仪器厂); 低温冰箱(青岛海尔); KDC-1042离心机(安徽科大创新有限公司中佳分公司)。

三、PON1 Q/R192位点基因多态性测定

1.DNA提取 被检者于清晨空腹取静脉血3 mL, EDTA抗凝, 用TKM法提取基因组DNA。

2.PCR 扩增包含PON1-192位点的基因片段。上游引物5'-TATTGTTGCTGTGGGACCTGA G-3', 下游引物3'-CACGCTAAACCCAAATACATC TC-5'[3]。PCR反应体系:总体积50 μ L, DNA模板1.0~2.0 μ g, 4× dNTP 20 nmol/L, 10× PCR buffer 5 μ L, Tag DNA聚合酶1 μ L, 加无菌双蒸水至终体积50 μ L。扩增条件: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性1 min, 61 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 循环35个周期, 72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物片段长度为99 bp, 使用含0.5 μ g/mL EB的1.8%琼脂糖凝胶电泳, 以相对分子质量20~500 bp Marker为标准检测扩增产物, 紫外线投射仪下观察结果。

3.限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RELP) 取PCR产物10 μ L, Alw I限制性内切酶1.6 μ L, 10× buffer 2.5 μ L, 加无菌双蒸水至终体积25 μ L。混匀后, 37 ℃水浴4 h, 酶切产物采用含0.5 μ g /mL EB的3%琼脂糖凝胶电泳。

四、PON1活性测定[4]

被检者均于清晨空腹经肘前静脉取血1 mL, 立即离心分离血清。采用分光光度法。取反应缓冲液(CaCl2 2 mmol/L, Tris-HCl 0.1 mmol/L, pH值8.0)2.6 mL, 加入5 mmol/L酚乙酸酯300 μ L, 于25℃水浴预温20 min。加入1∶ 10稀释的血清100 μ L, 反应90 s后加0.5 mmol/L EDTA-Na2 200 μ L终止。用分光光度计于波长270 nm处测定吸光度值, 同时设立血清对照和底物对照, 通过公式计算PON1活性。

五、统计学方法

计量资料数据采用 x̅± s表示, 两组间均数比较用student t检验, 组间率的比较采用四格表χ 2检验。所有数据用SPSS11.5 统计软件处理。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、2组基因型及等位基因频率的比较

AMI组与对照组间PON1 Q/R192位点QQ、QR、RR 3种基因型(见图1)及Q、R 2种等位基因频率分布差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

图1 PON1 Q/R192基因型电泳图

表1 AMI组与对照组PON1 Q/R192基因型及等位基因频率 [例(%)]
二、2组血清PON1活性的比较

AMI组PON1活性为(78.56± 16.69) U/mL, 明显低于健康对照组[(118.65± 30.25)U/mL](P< 0.01)。

三、不同PON1 Q/R192基因型间血清PON1活性的比较

AMI组与对照组不同PON1 Q/R192基因型间血清PON1活性相比差异有统计学意义(P< 0.01); AMI组内及对照组内PON1 Q/R192不同基因型间血清PON1活性相比差异无统计学意义(P> 0.05)。见表2。

表2 不同PON1 Q /R192基因型者间血清PON1活性的比较 ( x̅± s, U/mL)
讨 论

AMI发生是基因与环境相互作用的结果, 涉及诸多机制, PON1可能在其中发挥一定的作用。PON是由肝脏合成的一类与高密度脂蛋白(HDL)结合的芳香酯酶。PON能催化磷酸酯键的水解, 亦可参与脂质过氧化物的降解, 保护LDL免受氧化修饰, 从抑制动脉粥样硬化的形成, 对心血管具有保护作用[1]。PON1基因在192位及55位存在2个多态位点, 国外研究显示PON1 Q/R192多态性是冠心病的危险因素[5]。但国内报道[6]中国汉族人PON1 Q/R 192等位基因与冠心病的关系尚存在争议。本研究显示AMI组与对照组间PON1 192位点QQ、QR、RR 3种基因型及Q、R 2种等位基因频率分布差异无统计学意义, 提示PON1 Q/R192基因多态性与AMI的发生没有相关性, 这可能与本研究的例数太少有关。

AMI发病率越来越高, 脂质过氧化作用增强是动脉粥样硬化形成的重要机制, 各种原因导致机体抗氧化能力降低后, 容易发生动脉粥样硬化, 在此基础上导致AMI的发生。公认血清HDL可抑制动脉粥样硬化形成, 并认为主要是通过其上的某种酶来抑制脂质的过氧化达到此种功能。近年发现, 血清PON1在体内通过与载脂蛋白A1(apo A1)结合进而与HDL紧密结合。体外实验证实, PON1可以防止HDL的氧化修饰, 而经氧化修饰的HDL其脂质(主要是磷酯和胆固醇酯)和apo A1发生改变, 引起一系列理化性质的改变, 使HDL丧失了原有抗动脉粥样硬化的作用, 而具有致动脉粥样硬化的作用。另外PON1能保护LDL免受氧化修饰, 降低体内氧化型LDL水平, 并且PON1可以破坏和减少LDL氧化过程中产生的具有细胞毒作用的溶血磷脂。Mackness等[7]的一项前瞻性研究显示血清低PON1活性的个体比高PON1活性个体具有更大患冠心病的可能性。本研究显示AMI组血清PON1活性显著低于健康对照组。表明血清PON1活性测定为预测AMI的发生提供了一条新的途径, 提高血清PON1活性可能是预防AMI的有效措施之一。另外研究发现血清PON1活性与基因多态性之间无明显相关性, 不同基因型对血清PON1活性影响不大, 充分证明血清PON1活性对AMI的发生、发展所起的作用比基因多态性更重要。在引起心血管疾病的过程中, 低血清PON1活性和浓度比PON1的多态性起着更加决定性的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Boullier A, Bird DA, Chang MK, et al. Scavenger receptors, oxidized LDL, and atherosclerosis[J]. Ann NY Acad Sci, 2001, 947(1): 214-222. [本文引用:2]
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[3] 刘运海, 黄清, 杨期东, 等. 血清对氧磷酶L55M基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系[J]. 临床神经病学杂志, 2005, 18(4): 244-246. [本文引用:1]
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[5] Pfohl M, Koch M, Enderle MD, et al. Paraoxonase 192Gln/Arg gene polymorphism, coronary artery disease, and myocardial infarction in type 2 diabetes[J]. Diabetes, 1999, 48(3): 623-627. [本文引用:1]
[6] 马瑞欣, 王娈, 刘松, 等. 对氧磷酯酶192Gln/Arg基因多态性与老年人冠心病的相关性研究[J]. 中华老年医学杂志, 2002, 21(3): 215-216. [本文引用:1]
[7] Mackness B, Durrington P, McElduff P, et al. Low paraoxonase activity predicts coronary events in the caerphilly prospective study[J]. Circulation, 2003, 107(22): 2775-2779. [本文引用:1]