引用本文
吴蔚, 陈宁, 倪培华, 封启明, 赵钢. 脑梗死与C反应蛋白基因多态性关系的实验研究[J].检验医学, 2015,25(12): 959-964
WU Wei, CHEN Ning, NI Peihua, FENG Qiming, ZHAO Gang. Research on the correlation between cerebral infarction and C reactive protein gene polymorphism[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 959-964  
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《检验医学》编辑部
脑梗死与C反应蛋白基因多态性关系的实验研究
吴蔚1, 陈宁2, 倪培华2, 封启明1, 赵钢1
1.上海交通大学附属第六人民医院急诊科,上海 200233
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系,上海 200025

作者简介:吴蔚,女,1973年生,学士,副主任医师,主要从事急诊医疗工作。

通讯作者:赵钢,联系电话:021-64369181-8953。

摘要
目的 研究5个C反应蛋白(CRP)基因rs3122012、rs3116653、rs3116654、rs1130864、rs1205的单核苷酸多态性(SNP)位点与脑梗死的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对150例脑梗死患者和125名对照者的CRP基因多态性进行检测,同时检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、和血糖(Glu),并计算非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)。结果 脑梗死组患者的收缩压、舒张压、LDL-C和Glu明显高于对照组( P<0.01),而TG、TC、HDL-C和non-HDL-C结果2组间差异无统计学意义( P>0.05)。CRP rs3122012、rs3116653、rs3116654在上海地区人群中无多态性出现,rs1130864有CC、CT和TT型3种基因型,rs1205有AA、AG和GG型3种基因型,但脑梗死组患者的基因型和等位基因频率分布与对照组相比差异无统计学意义( P>0.05)。结论 脑梗死患者可能与高血压、高Glu等因素有关,与CRP基因rs3122012、rs3116653、rs3116654、rs1130864、rs1205的多态性无明显相关。
关键词: C反应蛋白; 脑梗死; 多态性
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0959-06
Research on the correlation between cerebral infarction and C reactive protein gene polymorphism
WU Wei1, CHEN Ning2, NI Peihua2, FENG Qiming1, ZHAO Gang1
1. Department of Emergency Medicine,the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233, China
2. Faculty of Medical Laboratory,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025, China
Abstract
Objective To investigate the relationship of cerebral infarction with C reactive protein (CRP) gene rs3122012,rs3116653,rs3116654,rs1130864 and rs1205 single nucleotide polymorphism (SNP) point.Methods The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to determine the CRP gene polymorphism in 150 patients with cerebral infarction and 125 controls. The triglyeride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and glucose (Glu) were determined. The non-HDL-C was calculated.Results The levels of systolic pressure, diastolic pressure, LDL-C and Glu were higher in patients with cerebral infarction than in the controls ( P<0.01). There was no statistical difference in TG, TC, HDL-C and non-HDL-C between the 2 groups. There was no polymorphism among CRP rs3122012,rs3116653 and rs3116654 in the population of Shanghai. The rs1130864 had CC,CT and TT genotypes,and the rs1205 had AA,AG and GG genotypes. The genotypes and the allele frequency distribution in cerebral infarction group had no statistical significance compared with those in the control group ( P>0.05).Conclusions There is no relationship between CRP gene rs3122012,rs3116653,rs3116654,rs1130864 and rs1205 polymorphism,and the occurrence of cerebral infarction may be related to hypertension and hyperglycemia.
Keyword: C reactive protein; Cerebral infarction; Polymorphism

脑梗死是严重危害人们身体健康的常见疾病, 其病因和发病机制尚未清楚, 但大量流行病学研究结果表明, 遗传基因在脑梗死发病过程中可能起着重要的作用。随着人类基因组计划的迅速发展, 脑梗死相关基因的定位和识别已成为研究的热点。

C反应蛋白(C reactive protein, CRP)基因序列变异可能有助于临床预测心脑血管疾病、炎症、肿瘤、系统性红斑狼疮等, 但是CRP水平变化是疾病发病的共同易感因素, 还是疾病标志物, 目前尚不清楚。近年来, 体外实验发现CRP能够调控多个参与动脉粥样硬化因子的表达, 而与CRP水平相关的CRP基因多态性较多, 其中部分基因多态性与心脑血管疾病相关[1]。

我们拟对CRP基因rs3122012、rs3116653、rs3116654、rs1130864、rs1205的单核苷酸多态性(SNP)位点与脑梗死的关系进行研究, 运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)结合测序验证, 对上海地区急性脑梗死患者进行研究, 以了解脑梗死与CRP基因多态性间的关系。

材料和方法
一、研究对象

选取上海交通大学附属第六人民医院和瑞金医院急诊和住院的急性脑梗死患者150例作为脑梗死组, 男86例, 女64例, 年龄64± 9岁, 按1995年第4届全国脑血管病学术会议修订的急性脑梗死诊断标准确诊, 无短暂性脑缺血发作, 并经头颅CT和/或磁共振成像(MRI)证实。选取健康体检者125名作为对照组, 男61名, 女64名, 年龄63± 9岁, 无急性脑梗死、心脏病等病史及家族遗传史, 头颅CT或MRI显示无明显异常。上述对象均为我国上海地区居住的汉族人, 彼此无血缘关系; 无阳性家族史, 病前未使用影响纤溶和凝血的药物, 也无饮酒、吸烟史, 无肝肾功能明显减退和甲状腺功能异常等代谢性疾患。2组间男、女性别构成和年龄间差异无统计学意义。

二、主要仪器和设备

dNTP、Taq DNA聚合酶购自上海普洛麦格公司; 引物由上海英骏生物技术有限公司合成; 限制性内切酶MseI购自上海生物工程公司。DL2000 DNA Marker购自大连宝生物公司。主要仪器由美国Bio-Rad公司的PTC200型PCR扩增仪、上海天能科技有限公司的垂直电泳槽、电泳仪和凝胶成像系统等组成。

三、方法

1.样本采集 所有被检者均禁食8~12 h, 晨起空腹采集抗凝全血5 mL, 并均测量血压。其中, 2 mL全血置于-80 ℃保存, 用作DNA提取; 另3 mL血作三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血糖(Glu)测定。

2.全血DNA抽取 采用碘化钾方法进行提取。

3.引物设计 根据CRP基因设计扩增各多态性的引物, 序列见表1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 CRP基因库序列号、引物序列、内切酶和基因型酶切片断长度

4.PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳 PCR反应总体积为25 μ L, 包含1× PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2)、200 μ mol/L dNTP、上下游引物各100 nmol/L、DNA 200 ng, Taq DNA聚合酶1 U。扩增循环参数:94 ℃预变性5 min, 然后按94 ℃40 s、55 ℃40 s、72 ℃ 90 s共35次循环, 最后72 ℃延长至10 min。PCR结束后取10 μ L PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μ g/mL溴化乙锭), 5 V/cm电泳40 min, 在紫外灯下观察PCR扩增结果。

5.基因型判断 10× 酶切缓冲液1μ L, MseⅠ 限制性内切酶0.5 μ L(5 U), PCR产物5 μ L, 去离子水3.5 μ L, 37 ℃恒温水浴箱过夜。取5 μ L酶切产物与1 μ L和6× 上样缓冲液混合, 行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 100 V电泳1~2 h, 最后经0.1%硝酸银染色, 1.5%NaOH-0.4%甲醛显色, 直至DNA条带显色为止。拍照观察、保存并分析结果。

6.PCR产物核苷酸序列测定 随机选取各基因位点野生型、杂合子、突变纯合子各2例的PCR产物, 由上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。

四、统计学方法

等位基因频率=(纯合子例数× 2+杂合子例数)× 1/2× 1/n。全部统计数据用SAS统计软件进行统计。脑梗死组和非脑梗死对照组临床资料的比较用单因素方差分析; 用计数资料表示基因型和等位基因频率分布, 组间分析、Hardy-Weinberg平衡检验(Hardy-Weinberg equilibrium, HME)采用χ 2检验。

结 果
一、对照组与脑梗死组的临床一般资料比较

表2显示, 脑梗死组的收缩压、舒张压、LDL-C和Glu明显高于对照组(P< 0.01), 而TG、TC、HDL-C和non-HDL-C结果差异均无统计学意义(P> 0.05)。

表2 脑梗死组与对照组的临床一般资料比较
二、CRP基因多态性位点的PCR结果

rs3122012的PCR扩增产物行电泳结果显示片段大小与预期相符, 为197 bp; rs3116653的PCR扩增产物片段大小与预期相符, 为154 bp; rs3116654的PCR扩增产物片段大小与预期相符, 为175 bp; rs1130864的PCR扩增产物片段大小与预期相符, 为250 bp; rs1205的PCR扩增产物片段大小与预期相符, 为225 bp, 见图1。

图1 CRP多态性位点的PCR产物琼脂糖凝胶电泳

三、CRP基因多态性位点的PCR-RFLP结果

rs3122012的PCR扩增产物消化经RsaⅠ 内切酶消化可区分出3种基因型:GG型为197 bp 1个片段, AG型为197、166和31 bp的3个片段, AA型为166、31 bp的2个片段。rs3116653的PCR扩增产物消化经HpyCH4 Ⅳ 内切酶消化可区分出3种基因型:CC型为1个154 bp片段, CG型为154、110和44 bp的3个片段, GG型为110、44 bp的2个片段。rs3116654的PCR扩增产物消化经BsrⅠ 内切酶消化可区分出3种基因型:TT型为1个175 bp片段, CT型为175、102和73 bp的3个片段, CC型为102、73 bp的2个片段。rs1130864的PCR扩增产物消化经HpyCH4 Ⅲ 内切酶消化可区分出3种基因型:TT型为1个250 bp片段, CT型为250、156和94 bp的3个片段, CC型为可见156、94 bp的2个片段。rs1205的PCR扩增产物消化经HpyCH4 Ⅲ 内切酶消化可区分出3种基因型:AA型为1个225 bp片段, AG型为225、144和81 bp 3个片段, GG型为可见144、81bp 2个片段。见图2。

图2 CRP多态性PCR-RFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳

四、CRP多态性位点的测序结果

对PCR-RFLP显示的各种类型多态性进行测序分析, 结果见图3。

图3 CRP多态性位点的PCR产物测序结果

五、CRP多态性位点的基因型和等位基因分布

rs3122012只有1种GG型, rs3116653只有1种CC型, rs3116654只有1种TT型。rs1130864有3种基因型, 其中对照组基因频率分布经HWE分析, χ 2=1.286 5, P=0.26; 脑梗死组基因频率分布经HWE分析, χ 2=0.029 5, P=0.86, 说明代表群体性基因分布状况。同时, 脑梗死组的基因型和等位基因频率分布与对照组相比差异也无统计学意义(P> 0.05), 见表3。

表3 CRP多态性位点的基因型和等位基因分布 [例(%)]

CRP多态性位点rs1205有3种基因型, 其中对照组基因频率分布经HWE分析, χ 2=0.009 4, P=0.92; 脑梗死组基因频率分布经HWE分析, χ 2=1.110 0, P=0.29, 说明代表群体性基因分布状况。同时, 脑梗死组的基因型和等位基因频率分布与对照组相比差异也无统计学意义(P> 0.05), 见表3。

讨 论

脑卒中是一类严重危害人类健康的疾病, 多种因素如高血压、糖尿病、房颤、高胆固醇血症、颈动脉狭窄、肥胖、睡眠呼吸暂停、红细胞比容增高、吸烟、生活方式和饮酒等有关。我们的研究也发现, 脑梗死患者常常伴有高血糖、高血压等多个因素。

CRP是一种全身性炎症的标志物, 具有多种生理功能, 不仅是多种疾病的标志物, 也与疾病发生、发展有关。CRP基因位于染色体1q21~23, 全长共2 399个核苷酸, 有2个外显子、1个内含子, 编码206个氨基酸残基, 编码与免疫系统及细胞间信号传递密切相关的蛋白, 是一种急性期反应蛋白, 能激活补体、促进吞噬并具有其他的免疫调控作用。CRP作为急性炎症的反应蛋白, 在感染、创伤、缺血性坏死、肿瘤侵润等情况下显著升高, 能反映炎症的程度, 而且参与动脉硬化损伤。血清CRP水平的测定已引起人们的广泛关注[1], 但CRP基础水平的遗传决定性是否可以作为更为稳定的遗传标志物还未得到证实, CRP含多达40个SNP位点。因此, 研究标签SNP可提供该区域内大多数的遗传多态模式, 极大提高关联分析的有效性。

在CRP与心血管疾病研究方面, 目前认为, CRP水平升高者发生急性脑卒中的机率是正常者的2倍, 是发生心肌梗死者的3倍, 说明CRP与血栓形成和发展有一定的关系。2000年Cao等[2]报道了CRP基因rs1800947多态性可能为动脉粥样硬化易感性的候选基因。而对2 260名参与冠心病危险调查的年轻人研究发现, CRP rs2794521多态性是早期冠状动脉改变的影响因子[3]。说明在欧美人群中, CRP某些基因的多态性可能与冠心病发病有关。但是, 在不同人群中有一定异质性, 受地域、环境和冠心病类型的影响, 中国人群rs1800947基因多态性都与冠心病发病无关[4]。本研究发现, CRP基因rs3122012、rs3116653、rs3116654、rs1130864、rs1205的多态性与上海地区的脑梗死发生无明显相关。

Zacho等[5]发现rs1205的AA基因型与血浆CRP水平相关, 但不同CRP基因型在普通人群组、缺血性心脏病组和脑中风组的危险比与1.0之间没有显著差异。所以, 作者认为CRP遗传变异会增加血浆CRP水平。马铮等[6]发现脑梗死患者CRP rs1800947基因多态性中G等位基因频率大大增加, 而C等位基因频率越高其预后越好, 与预后效果呈正相关。本研究发现, 虽然rs1130864在对照组中存在CC和CT型, 在脑梗死组存在CC、CT和TT型, 但2组基因型和等位基因频率之间差异无统计学意义; rs1205在对照组和脑梗死组均存在AA、AG和GG型, 基因型和等位基因频率也无显著差异, 说明rs1130864和rs1205基因型与脑梗死发生无关。因此, 高血浆CRP水平与缺血性心脑血管病风险之间可能没有因果关系[7], 而CRP水平增加仅是动脉粥样硬化和缺血性心脑血管病的一种表现, 部分CRP等位基因频率的变化可能与疾病预后有关[8]。

总之, 本研究发现上海地区脑梗死发生和高Glu、高血压有关, 而和CRP rs3122012、rs3116653、rs3116654、rs1130864、rs1205基因多态性无明显相关, 在日后研究中拟扩大样本量和多态性位点来进一步研究CRP基因多态性与脑梗死发生的关系。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 翁良, 赵昕. C反应蛋白基因多态性及冠心病相关性研究进展[J]. 中国实验诊断学, 2008, 12(8): 1063-1066. [本文引用:2]
[2] Cao H, Hegele RA. Human C-reactive protein (CRP)1059G/C polymorphism[J]. J Hum Genet, 2000, 45(2): 100-101. [本文引用:1]
[3] Pessi T, Eklund C, Huhtala H, et al. CRP and FCGR2A genes have an epistatic effect on carotid artery intima-media thickness: the cardiovascular risk in young finns study[J]. Int J Immunogenet, 2009, 36(1): 39-45. [本文引用:1]
[4] 戴振宇, 徐力辛, 田克钧, 等. CRP+1059G/C基因多态性与冠心病相关性的临床荟萃分析[J]. 浙江临床医学, 2009, 11(3): 232-235. [本文引用:1]
[5] Zacho J, Tybjaerg-Hansen A, Jensen JS, et al. Genetically elevated C-reactive protein and ischemic vascular disease[J]. N Engl J Med, 2008, 359(18): 1897-1908. [本文引用:1]
[6] 马铮, 张志彬. CRP基因多态性与脑梗塞发病及预后的关系[J]. 吉林大学学报(医学版), 2007, 33(3): 541. [本文引用:1]
[7] Perry TE, Muehlschlegel JD, Liu KY, et al. C-reactive protein gene variants are associated with postoperative C-reactive protein levels after coronary artery bypass surgery[J]. BMC Med Genet, 2009, 10(1): 38-48. [本文引用:1]
[8] Gallicchio L, Chang H, Christo DK, et al. Single nucleotide polymorphisms in inflammation-related genes and mortality in a community-based cohort in Washington County, Maryland [J]. Am J Epide, 2008, 167(7): 807-813. [本文引用:1]