引用本文
石铭, 张勇, 祝英华, 花艳艳, 韩博. 不同基因型乙型肝炎病毒患者拉米夫定治疗期间YMDD突变株的变化分析[J].检验医学, 2015,25(12): 956-958
SHI Ming, ZHANG Yong, ZHU Yinghua, HUA Yanyan, HAN Bo. Study on the YMDD mutation during lamivudine therapy in hepatitis B patients with different HBV genotypes[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 956-958  
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不同基因型乙型肝炎病毒患者拉米夫定治疗期间YMDD突变株的变化分析
石铭, 张勇, 祝英华, 花艳艳, 韩博
大连市第六人民医院,辽宁 大连 116031

作者简介:石铭,男,1972年生,博士,副主任技师,主要从事肝病研究。

摘要
目的 研究不同基因型乙型肝炎病毒(HBV)患者拉米夫定治疗期间酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)突变株的变化。方法 采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序法分别对115例接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者血清进行乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)水平、YMDD突变株及基因型检测。结果 拉米夫定治疗时间<12个月、12~24个月及>24个月患者的HBV DNA阳性率分别为75%、35%、16%,YMDD变异率分别为22%、54%、100%。对115例乙型肝炎患者进行HBV基因分型发现,B型占17%,C型占75%,B、C混合型占8%;其中,B型、C型患者中YMDD变异率分别为21%、19.5%,B、C混合型患者中未发现YMDD变异。HBV DNA与HBV的YMDD变异率无明显相关性( P>0.05)。结论 拉米夫定治疗期间, HBV的YMDD变异不受病毒基因型的影响。
关键词: 乙型肝炎病毒; 基因型; 拉米夫定; YMDD突变
中图分类号:R512.6 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0956-03
Study on the YMDD mutation during lamivudine therapy in hepatitis B patients with different HBV genotypes
SHI Ming, ZHANG Yong, ZHU Yinghua, HUA Yanyan, HAN Bo
The Sixth People's Hospital of Dalian, Liaoning Dalian 116031, China
Abstract
Objective To study the tyrosine-methionine-aspartate-aspartate (YMDD) mutation during lamivudine therapy in hepatitis B patients with different Hepatitis B virus (HBV) genotypes.Methods Real-time fluorescence polymerase chain reaction (PCR) and gene sequencing were used for the detection of HBV DNA levels, YMDD mutants and HBV genotypes in serum samples of 115 hepatitis B patients during lamivudine therapy.Results The HBV DNA positive rates in patients with lamivudine therapy time less than 12 months, 12 to 24 months and more than 24 months were 75%, 35% and 16%, and YMDD mutation rates were 22%, 54% and 100%, respectively. Among 115 hepatitis B patients in Dalian, the proportions of genotype B, C and B-C mixed-type were 17%, 75% and 8%, respectively. The YMDD mutation rates of genotype B and C were 21% and 19.5%. There was no YMDD mutation in patients with B-C mixed-type. It showed no significant correlation between HBV DNA genotypes and YMDD mutation rates ( P>0.05).Conclusions During lamivudine therapy, there is no relation between the YMDD mutation and the HBV genotypes.
Keyword: Hepatitis B virus; Genotype; Lamivudine; Tyrosine-methionine-aspartate-aspartate mutation

乙型肝炎病毒(HBV)具有高度的基因异质性, 根据病毒全基因序列的差异性≥ 8%可分为A~H 8个基因型[1], 不同基因型HBV感染后的临床病情轻、重对治疗的反应是不同的。拉米夫定治疗慢性乙型肝炎能够快速抑制病毒复制, 副作用小、耐受性好。但长期使用容易使患者HBV P基因区的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)片段发生突变, 使患者对拉米夫定产生耐药性, 导致治疗失败[2]。目前拉米夫定与HBV基因型治疗应答之间的关系尚不明确, 不同HBV基因型与拉米夫定耐药突变之间的关系也需进一步研究, 国内、外各项研究结果存在争议。我们采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序法对115例接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者进行乙型肝火病毒基因(HBV DNA)定量、YMDD耐药株及HBV基因型检测, 探讨拉米夫定治疗期间HBV DNA的阳性率、YMDD变异率变化以及各基因型与拉米夫定耐药突变株之间的关系。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 大连市第六人民医院门诊和住院慢性乙型肝炎患者115例, 其中男66例, 女49例, 年龄12~60岁。均已接受拉米夫定治疗1~36个月。诊断依据参照2000年9月西安《病毒性肝炎防治方案》会议的诊断标准[3], 所有患者治疗前乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性6个月以上, HBV DNA> 104拷贝/mL, 丙氨酸氨基转移酶(ALT)> 2倍正常值高限(ULN)。所有患者均未发现其他肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)合并感染。

2. 试剂与仪器 HBV基因分型及YMDD基因突变诊断试剂盒由上海复星医学科技发展有限公司提供; 血清HBV提取及定量检测试剂由上海科华公司提供。ABI 7500实时PCR检测系统和ABI 3130基因测序仪为美国PE公司产品。

二、方法

1.HBV DNA提取 取100 μ L血清样本, 加入100 μ L核酸提取液A, 振荡混匀10 s, 12 000 r/min(离心半径4.5 cm)离心10 min, 弃上清; 再加入50 μ L核酸提取液B至沉淀中, 振荡混匀10 s, 100 ℃沸水浴10 min, 12 000 r/min(离心半径4.5 cm)离心2 min, 上清液用于HBV DNA定量、基因分型及YMDD变异株检测。

2.HBV DNA定量检测 严格按照试剂盒说明书操作。

3.HBV基因分型及YMDD变异株的检测 该检测先通过多重PCR扩增获得含有待检测位点的基因片断, 然后进行多重连接酶检测反应(LDR), 最后将多重LDR产物在ABI 3130基因测序仪中进行测序仪电泳, 读取结果。多重PCR反应条件:37 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 min, 再按94 ℃ 15 s→ 54 ℃ 30 s→ 72 ℃ 30 s循环35次, 72 ℃ 5 min。多重LDR反应条件:94 ℃ 2 min, 再按94 ℃ 30 s→ 55 ℃ 120 s循环15次。

三、统计学方法

实验数据以 x̅± s表示, 采用SPSS10.0软件统计处理, 并用Radit检验进行组间比较, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、拉米夫定治疗期间HBV DNA阳性率及YMDD变异分析

治疗前检测115例患者血清HBV DNA水平的对数值为7.58± 1.32。接受拉米夫定治疗后有77例患者HBV DNA转阴, 另有38例患者HBV DNA阳性。根据拉米夫定治疗时间< 12个月、12~24个月及> 24个月对患者进行分组, 不同治疗时间HBV DNA阳性率及YMDD变异率见表1。

表1 拉米夫定治疗时间与HBV DNA阳性率及YMDD变异率 [例(%)]
二、HBV基因分型与YMDD变异分析

115例乙型肝炎患者治疗前、后进行HBV基因分型检测。B基因型有19例(17%), C基因型有87例(75%), B、C混合型9例(8%), 未发现A、D、E、F、G、H等基因型。B基因型、C基因型及B、C混合型患者在治疗期间发生YMDD变异的频率差异无统计学意义, 结果见表2。

表2 115例乙肝患者HBV基因型与YMDD变异 [例(%)]
讨 论

流行病学调查表明, 不同基因型的HBV地理分布不同。我国以B、C 型感染为主, 北方以C 型为主, 由北向南, B 型感染率逐渐增高, 少数地区存在A、D型[4]。目前认为, 不同地区优势基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点, 是病毒变异后进化的结果。本研究对大连地区115例乙型肝炎患者进行HBV基因分型发现, B型占17%, C型占75%, B、C混合型占8%, 未发现A、D、E、F、G、H等基因型, 与宋淑静等[5]的研究结果基本一致。

不同基因型的HBV感染后的疾病进程和后果不同, 对抗病毒治疗的应答情况也不同。拉米夫定是最早批准用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的核苷类药物, 由于其抑制病毒复制效果显著, 耐受性好, 副作用小, 因而在临床上应用十分普遍, 是治疗慢性乙型肝炎的首选药物之一。但长期使用拉米夫定单一治疗容易出现耐药突变。感染不同HBV基因型的乙型肝炎患者对拉米夫定的治疗应答是否存在差异目前存在较多争论, HBV基因型与YMDD变异的关系也有不同意见。部分学者[6]认为HBV基因型与YMDD变异发生率有关。也有学者[7~9]认为HBV基因型与YMDD变异发生率没有明显关系。

本研究通过对115例乙型肝炎患者拉米夫定治疗期间进行YMDD变异和基因型检测发现, 随着拉米夫定治疗时间的延长, HBV DNA阳性率逐渐降低, 发生HBV YMDD变异率在逐渐增加, 提示YMDD变异可能是HBV DNA反弹的主要原因; 而不同病毒基因型治疗后仍为HBV DNA阳性的患者中, 发生YMDD变异的频率没有明显的相关性(P> 0.05), 与国内外的某些报道一致。拉米夫定耐药可能是YMDD变异株逐渐积累的过程, 在治疗2年之内的患者中病毒变异率< 54%, 而治疗2年以上的患者中突变率达到了100%。一旦出现YMDD变异, 继续采用拉米夫定进行治疗将没有意义[10], 可以考虑更换其他抗病毒药物或采用联合治疗、序贯治疗等方案。

本研究由于缺乏系统的大样本研究, HBV基因型与YMDD变异的关系尚需进一步确定, 这种关系的建立, 将为慢性乙型肝炎的抗病毒治疗方案提供重要参考依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[6] 吴诗品, 于杰, 周建良, 等. 乙型肝炎病毒基因型与拉米夫定治疗疗效关系的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004 , 24(12) : 973-976. [本文引用:1]
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