引用本文
黄海, 张筠源, 刘鑫, 黄韻祝, 毕瑩, 刘丽荣. 吴茱萸碱抑制胃癌SGC-7901细胞生长及诱导凋亡作用的研究[J].检验医学, 2015,25(12): 952-955
HUANG Hai, ZHANG Yunyuan, LIU Xin, HUANG Yunzhu, BI Ying, LIU Lirong. Study of evodiamine on proliferation inhibition and apoptosis induction in human gastric cancer cell line SGC-7901[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 952-955  
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吴茱萸碱抑制胃癌SGC-7901细胞生长及诱导凋亡作用的研究
黄海1, 张筠源1, 刘鑫1, 黄韻祝2, 毕瑩1, 刘丽荣1
1.贵阳医学院医学检验系临床生化教研室,贵州 贵阳 550004
2.贵阳医学院附属医院生化科,贵州 贵阳 550004

作者简介:黄 海,男,1975年生,博士,副教授,主要从事临床生化及分子生物学研究。

基金:贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究专项资助项目(2009-60)
摘要
目的 观察吴茱萸碱对胃癌SGC-7901细胞凋亡的生长抑制作用,并探讨可能的分子机制。方法 体外培养人胃癌SGC-7901细胞,分别用0.5、1.0、1.5 μmol/L吴茱萸碱及吴茱萸碱+20 μmol/L胱天蛋白酶抑制剂(Z-VAD-FMK)作用于SGC-7901细胞12、24和36 h。四唑盐(MTT)比色法观察吴茱萸碱对SGC-7901细胞增殖活性的影响。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞,流式细胞仪检测SGC-7901细胞凋亡的情况。结果 吴茱萸碱能抑制SGC-7901细胞增殖,MTT结果显示具有时间和剂量的依赖性;流式细胞仪结果显示吴茱萸碱可诱导SGC-7901细胞凋亡,且随剂量和时间的增加作用增强;Z-VAD-FMK可部分抑制吴茱萸碱诱导该细胞的凋亡作用。结论 吴茱萸碱能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡,且在加入Z-VAD-FMK后吴茱萸碱仍可诱导其凋亡,但作用减弱。该研究结果提示吴茱萸碱诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡除胱天蛋白酶途径外,还存在其他的诱导凋亡途径。
关键词: 吴茱萸碱; 胃癌; SGC-7901细胞; 凋亡
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0952-04
Study of evodiamine on proliferation inhibition and apoptosis induction in human gastric cancer cell line SGC-7901
HUANG Hai1, ZHANG Yunyuan1, LIU Xin1, HUANG Yunzhu2, BI Ying1, LIU Lirong1
1. Department of Clinical Biochemistry,Guiyang Medical College,Guizhou Guiyang 550004,China
2. Department of Biochemistry,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guizhou Guiyang 550004,China
Abstract
Objective To observe the effect of evodiamine on proliferation inhibition and apoptosis induction to SGC-7901 cells in human gastric cancer and investigate the possible molecular mechanism.Methods The SGC-7901 cells were cultured in vitro with 0.5, 1.0, 1.5 μmol/L evodiamine respectively for 12, 24 and 36 h. Both evodiamine and caspase inhibitor Z-VAD-FMK were also added into the cultured SGC-7901 cells for 12, 24 and 36 h. The cells were stained by Annexin V-FITC/PI. Monotetrazolium (MTT) and flow cytometry were performed to detect the situation of evodiamine on cellular proliferation and apoptosis.Results MTT detection results indicated that the proliferation of SGC-7901 cells was inhibited by evodiamine with time and dose dependence. Flow cytometry results showed that evodiamine induced the apoptosis of SGC-7901 cells more significently with the increasing of time and dose dependence, and the caspase inhibitor Z-VAD-FMK could not entirely inhibit the apoptosis.Conclusions The proliferation of SGC-7901 cells may be inhibited by evodiamine, and its apoptosis is also induced by evodiamine. Evodiamine with Z-VAD-FMK can also induce SGC-7901 cell apoptosis. However, without Z-VAD-FMK, evodiamine can inhibit SGC-7901 cell proliferation and induce cell apoptosis more obviously. The results indicate that there exists other apoptosis pathway except of caspase pathway, for which evodiamine induces SGC-7901 cells in human gastric cancer.
Keyword: Evodiamine; Gastric cancer; SGC-7901 cell; Apoptosis

胃癌是我国常见肿瘤之一。研究表明, 胃癌的发生、演变和细胞凋亡失控密切相关。因此, 有效控制肿瘤细胞的异常增殖、诱导其凋亡是治疗肿瘤的有效途径。近年来, 从祖国传统医学中发掘新的抗癌药物用于肿瘤治疗已成为当前一个新的研究方向[1]。吴茱萸碱是自中草药吴茱萸中分离出的最主要、具有生物活性的生物碱之一[2, 3], 已有报道吴茱萸碱具有治疗前列腺癌DU145和PC3[4], 白血病U937[5], 结肠癌COLO-205[6], 耐药乳腺癌NCI/ADR-RES[7]等的作用。我们将吴茱萸碱作用于体外胃癌SGC-7901细胞培养, 探讨吴茱萸碱抗胃癌SGC-7901细胞的机理, 为吴茱萸碱抗胃癌的治疗和应用提供可靠的实验依据。

材料和方法
一、材料

1. 仪器与试剂 日本SANYO MCO-175型CO2培养箱; 日本NIKON ECLIPSE TE2000-U型倒置显微镜; 美国BioTeK ELX 800酶标仪; 美国BD FACSAria流式细胞仪; 改良型RPMI-1640培养基、双抗(美国HyClone 公司); 胎牛血清(四季青公司); Hanks液(捷瑞生物工程上海有限公司); 胰酶消化液(美国HyClone公司); 吴茱萸碱标准品(中国药品生物制品检定所); 胱天蛋白酶抑制剂(Z-VAD-FMK)(碧云天公司); 二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Alderich公司); MTT(BETTER公司); 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂盒(美国BD公司)。

2. 细胞株 胃癌SGC-7901细胞株由贵阳医学院分子生物学重点实验室提供。

二、方法

1. 细胞培养 SGC-7901细胞为贴壁细胞。用含10%胎牛血清、双抗(100 U/mL青霉素, 100 U/mL链霉素)的改良型RPMI-1640培养基, 接种在25 mL培养瓶中, 5% CO2、37℃恒温培养24 h后传代进行实验[8], 以2× 104细胞/孔接种于无菌96孔培养板中用于分析。

2. MTT法[9]测定细胞存活率 设置正常对照组10%FBS的RPMI-1640培养, 分别设置吴茱萸碱的终浓度为0.5、1.0和1.5 μ mol/L, 共3个实验组。各实验组分别设6个复孔, 96孔板培养12、24和36 h后, MTT法在570 nm波长处测定。

3. 流式细胞分析仪分析[10] 分别设置吴茱萸碱终浓度为0.5、1.0和1.5 μ mol/L, 分别同时加入Z-VAD-FMK至终浓度为20 μ mol/L[11]。培养12、24、36 h后离心, 加入4 ℃预冷PBS清洗细胞1~2次, 1 000r/min(离心半径5.3 cm)离心5min, 弃上清。用200 μ L Binding Buffer悬浮细胞, 并移入流式管中。每管加入5 μ L Annexin V-FITC混合后, 再加入5 μ L碘化丙啶(PI), 混匀。室温、避光反应10 min, 用流式细胞仪检测。

三、统计学方法

实验组和对照组均重复3次操作, 结果用 x̅± s表示。所有数据用SPSS11.5统计学软件进行对数据进行单因素方差分析。

结 果
一、不同浓度吴茱萸碱对SGC-7901细胞的增殖抑制作用

吴茱萸碱的多个剂量组均可抑制SGC-7901细胞的存活率, 而且呈作用时间、药物浓度依赖性。酶标仪检测结果显示作用12 h后各实验组抑制SGC-7901细胞作用不明显, 作用24和36 h后, 不同浓度的吴茱萸碱均可抑制SGC-7901细胞增殖, 且随剂量和时间的增加抑制率的作用增强。见表1。

表1 不同浓度吴茱萸碱在12、24和48 h对SGC-7901细胞抑制作用比较 ( x̅± s)
二、流式细胞仪检测

1.5 μ mol/L吴茱萸碱作用于SGC-7901细胞24 h后可明显诱导SGC-7901细胞早期凋亡, 且1.5 μ mol/L吴茱萸碱+20 μ mol/L Z-VAD-FMK作用24 h的情况下也可诱导SGC-7901细胞早期凋亡, 但不如前者明显。见图1。

图1 吴茱萸碱、吴茱萸碱+Z-VAD-FMK作用于SGC-7901细胞的流式图

三、SGC-7901细胞凋亡率比较

将1.5 μ mol/L吴茱萸碱和1.5 μ mol/L吴茱萸碱+20 μ mol/L Z-VAD-FMK分别作用胃癌SGC-7901细胞12、24和36 h, 细胞凋亡率与对照组相比差异有统计学意义。说明吴茱萸碱对于SGC-7901细胞的凋亡作用在加入Z-VAD-FMK后仍然显著。见表2。

表2 1.5 μ mol/L吴茱萸碱组、1.5 μ mol/L吴茱萸碱+20 μ mol/L Z-VAD-FMK作用SGC-7901细胞的凋亡率 ( x̅± s)
讨 论

本研究采用吴茱萸碱作用于胃癌SGC-7901细胞株, 观察对其生长和诱导凋亡的作用。实验结果表明吴茱萸碱可抑制SGC-7901细胞的增殖, 其增殖率随着吴茱萸碱浓度的递增而逐渐递减, 同时随着时间的增长而呈降低趋势。MTT法检测结果显示吴茱萸碱对SGC-7901细胞增殖的抑制, 半数抑制浓度为1.5 μ mol/L, 抑制能力随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。

肿瘤的发生是多种基因的异常表达导致细胞过度增殖和凋亡抑制的结果, 从肿瘤的治疗角度考虑, 抑制肿瘤细胞的增生只能延缓肿瘤的进展, 不能治愈恶性肿瘤, 而诱导肿瘤细胞的凋亡才是治疗肿瘤的有效途径, 故研究诱导肿瘤细胞的凋亡对恶性肿瘤的治疗具有重要意义。通过流式细胞分析仪结合Annexin Ⅴ -FITC/PI检测, 吴茱萸碱可在作用胃癌SGC-7901细胞24 h后有效诱导其早期凋亡。在加入Z-VAD-FMK后, 吴茱萸碱仍可表现出较强的抑制作用, 初步提示在吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡过程中吴茱萸碱不但可以激活胱天蛋白酶通路, 而且还可以在胱天蛋白酶被抑制, 阻断该途径的情况下, 可能还有其他的通路诱导该细胞凋亡。

吴茱萸碱诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡, 是其对该细胞体外抑制增殖作用的重要分子机制。除胱天蛋白酶凋亡通路参与外, 可能还涉及其他的机制, 有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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