引用本文
张晨光, 张婧婧, 庞桂芝, 朱琳琳, 化瑞芳, 张金华, 贺志安, 胡丽华. 血型不规则抗体检测的方法学评价[J].检验医学, 2015,25(12): 929-933
ZHANG Chenguang, ZHANG Jingjing, PANG Guizhi, ZHU Linlin, HUA Ruifang, ZHANG Jinhua, HE Zhian, HU Lihua. Methodology evaluation for the determination of blood type irregular antibodies[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 929-933  
Permissions
Copyright©2010, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
血型不规则抗体检测的方法学评价
张晨光1, 张婧婧2, 庞桂芝3, 朱琳琳2, 化瑞芳2, 张金华4, 贺志安2, 胡丽华1
1. 华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科,湖北 武汉 430022
2. 新乡医学院医学检验系,河南 新乡 453003
3. 新乡市中心血站,河南 新乡 453000
4. 新乡医学院护理学院,河南 新乡 453003

作者简介:张晨光,女,1972年生,副教授,主要从事免疫血液学的教学和科研工作。

通讯作者:胡丽华,联系电话:027-85726312。

基金:河南省教育厅资助项目(2008A320015、2009GGJS-083)
摘要
目的 寻找简便、快速、敏感的用于红细胞不规则抗体筛选的试验方法。方法 收集6例临床疑难病例样本和1份IgG型试剂,采用盐水法、木瓜酶法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法平行检测患者血清中不规则抗体的效价,比较5种方法的敏感性、特异性。结果 盐水法仅检出IgM类不规则抗体;木瓜酶法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法在检测IgG类抗体效价时差异不大,木瓜酶法的敏感性略低,微柱凝胶法对弱阳性IgG抗体检测的敏感性最高,但4种方法间差异无统计学意义( P>0.05),相关性较好( r>0.99)。结论 盐水法不能检出IgG抗体;木瓜酶法检测IgG抗体具有一定的局限性;凝聚胺法简便、快速,但为手工操作,不易标准化;抗人球蛋白法需要反复洗涤红细胞,费时,不便于开展大规模筛查;微柱凝胶法操作简便迅速、敏感性高、重复性好、易于标准化,适于临床输血前和孕妇产前大批量抗体筛选,是检测IgG抗体最为敏感的方法。
关键词: 不规则抗体; 凝聚胺法; 木瓜酶法; 抗人球蛋白试验; 微柱凝胶试验
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0929-05
Methodology evaluation for the determination of blood type irregular antibodies
ZHANG Chenguang1, ZHANG Jingjing2, PANG Guizhi3, ZHU Linlin2, HUA Ruifang2, ZHANG Jinhua4, HE Zhian2, HU Lihua1
1. Department of Clinical Laboratory, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430022, China
2. Department of Medical Tests, Xinxiang Medical University,Henan Xinxiang 453003, China
3. Xinxiang Blood Center, Henan Xinxiang 453000, China
4. Nursing Institute, Xinxiang Medical University, Henan Xinxiang 453003, China
Abstract
Objective To search a simple, rapid and sensitive method for screening red blood cell irregular antibodies.Methods 7 samples with red blood cell irregular antibodies(6 from clinical cases and 1 IgG reagent) were detected by saline test, papain test, polybrene test, anti-human globulin test and microcolumn gel test. The specificities and sensitivities of 5 methods were compared.Results Only the irregular antibody of IgM nature was detected by saline test. There was no obvious difference in the titer of determining the irregular antibodies of IgG nature by papain test, polybrene test, anti-human globulin test and microcolumn gel test. The papain test was less sensitive than other 3 methods, and the microcolumn gel test was the most sensitive in the determination of the weakly positive irregular antibodies of IgG nature. There was no significant difference between the 4 methods ( P>0.05), and there was a good correlation between the 4 methods( r>0.99).Conclusions The saline test is not suitable for the detection of IgG antibody. The papain test has certain limitation in determination of IgG antibody. The polybrene test is the most simple and convenient method for the determination of irregular antibodies of IgG nature, but it is not standardized easily. The anti-human globulin test is complicated because of multiple wash of red blood cells, and it is not suitable for extensive screening. The microcolumn gel test with good reproducibility and sensitivity is a simple and fast method and is standardized easily. It is suitable for clinical massive samples with the detection of IgG antibodies before blood transfusion and antenatal screening.
Keyword: Irregular antibody; Polybrene test; Papain test; Anti-human globulin test; Microcolumn gel test

血型不规则抗体是指抗-A、抗-B以外的所有抗体, 多为免疫性IgG型, 如抗-D、抗-cE、抗-E、抗-Ce、抗-Tja、抗-Dia、抗-Jka等, 是引起新生儿溶血病、血型鉴定困难、疑难配血以及输血不良反应等的主要原因之一[1~5]。特别是对于有输血史、妊娠史的患者, 开展不规则抗体筛查是确保输血安全和预防新生儿溶血病的重要措施。目前各级医院、血站的检测方法有盐水法、聚凝胺法、蛋白酶法、抗人球蛋白法、全自动微柱凝胶法等, 由于各种方法的实验原理不同, 操作方法各异, 技术要求不一, 影响因素也不尽相同, 致使因不规则抗体引起的新生儿溶血病和输血反应时有发生[4~7]。我们同时采用上述5种方法对临床疑难样本进行不规则抗体筛选, 比较几种方法的优缺点, 寻求最适合临床开展工作的简便、快速、理想的红细胞不规则抗体筛选方法。

材料和方法
一、对象

2006年10月至2008年12月新乡市中心血站共收集到临床需要输血患者和孕妇产前检查的各种疑难样本6例, 男3例, 女3例, 年龄20~68岁, 部分患者有输血史及多次妊娠史。上述样本均用盐水法、凝聚胺法和抗人球蛋白法进行不规则抗体筛选, 抗体阳性者鉴定其特异性。6例样本分别为抗-D 2例、抗-E 1例、抗-Ce 1例、抗-M 1例、抗-Jka 1例。另1份样本为购自上海血液生物医药有限公司的IgG抗-D试剂。

二、仪器与试剂

日本KUBOTA公司KA-2000型血库专用离心机; 芬兰进口可调移液器; 12× 75 mm玻璃试管; 北京市医疗设备厂37℃水浴箱; 聚凝胺试剂购于台湾BASO生物制品公司; 微柱凝胶抗人球蛋白卡购于长春博迅生物技术有限责任公司; IgG抗-D、抗人球蛋白试剂(抗-IgG、多特异性抗-IgG+抗-C3d)、0.2 mol/L 2-巯基乙醇(2-Me)、筛选细胞(3个细胞)、谱细胞(10个细胞, 所含主要抗原有D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka、Jkb)均由上海血液生物医药有限公司提供; 1%木瓜酶应用液由新乡市中心血站自制。

三、样本处理

采集受检者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝静脉血液样本3 mL, 使用前对样本进行离心, 确保血浆中无纤维蛋白凝块的干扰。

四、检测方法

1.盐水法 100 μ L血清与50 μ L红细胞试剂混合, 室温孵育1 min, 以3 100 r/min(离心半径9.3 cm)离心15 s, 轻微摇动试管, 观察结果。

2.凝聚胺法 按盐水法加样后加入0.7 mL低离子介质(LIM), 混匀, 室温孵育1 min, 再加入100 μ L聚凝胺应用液, 混匀后静置15 s, 以3 100 r/min(离心半径9.3 cm)离心1 min, 弃上清液(残留约0.1 mL), 轻轻摇动试管能看到凝块, 再加入100 μ L中和溶液并轻摇试管, 1 min内肉眼观察结果。若为聚凝胺引起的非特异性凝集在1 min内自然散开, 若是抗原抗体引起的特异性凝集则不会散开。

3.木瓜酶法 准确称取木瓜蛋白酶精粉1.000 g溶解于100 mL磷酸盐缓冲液(pH值5.5)中, 充分摇匀后离心取上清, 分装冰冻保存-20 ℃以下备用。先盐水法加样和观察结果, 然后再加入1%木瓜蛋白酶溶液100 μ L, 混匀置37 ℃水浴中30 min, 离心和观察结果同盐水法。

4.抗人球蛋白法 如盐水法加样和观察结果后, 然后置37 ℃孵育30 min, 用生理盐水洗涤红细胞3次后扣干, 再加入抗人球蛋白试剂50 μ L, 离心和观察结果同盐水法。

5.微柱凝胶法 使用前先将微柱凝胶卡离心, 以防凝胶界面不整齐影响反应结果。吸取受检者血清25 μ L与25 μ L筛选细胞置于凝胶管中, 在37 ℃专用孵育箱内孵育15 min, 最后放入专用卡式离心机离心, 离心速度和时间均按厂商推荐标准进行。离心后根据红细胞沉积于微柱凝胶管的部位判定阴阳性结果。

6.抗体效价测定 将样本用不规则抗体阴性的AB浆倍比稀释, 通过上述5种方法与试剂红细胞(对应抗体的纯合子抗原的谱细胞)反应, 测其效价, 以最先出现“ ± ” 的凝集强度为效价终点。

五、结果判定

1.试管法 红细胞凝集程度参照《全国临床检验操作规程》(第3版)[8], 以4+、3+、2+、1+、± 表示, 无凝集反应为阴性。

2.微柱凝胶法 红细胞全部滞留在凝胶上层, 下部凝胶背景清晰判为4+; 红细胞大部分滞留在凝胶上层, 下部凝胶背景较清晰判为3+; 大部分红细胞滞留在凝胶中上层, 下部凝胶背景略显红色判为2+; 大部分红细胞沉积在微柱底部, 少量红细胞滞留在凝胶介质中下层判为1+; 红细胞全部沉积在微柱底部, 上部凝胶背景清晰判为阴性。

3.红细胞凝集强度计分标准 采用威斯(Warsh)方法: 4+为8分、3+为6分、2+为4分、1+为2分、± 为1分、-为0分。

六、统计学方法

采用SPSS10.0的χ 2检验和Microsoft Excel 2003的相关性分析。由于盐水法IgG型不规则抗体不凝集, 仅凝聚胺法、木瓜酶法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法各组得分进行统计学处理和相关性分析。

结 果
一、不同方法抗体效价的比较

盐水法只能检出IgM类的不规则抗体, 抗人球蛋白法和凝聚胺法在检测IgG红细胞抗体效价时差异不大, 木瓜酶法在检测IgG抗体效价时敏感性略低, 微柱凝胶法较其他3种方法敏感, 检出的效价最高。结果见表1。

表1 5种方法检出不规则抗体的敏感性比较
二、含有IgG抗体样本倍比稀释后凝集强度

1~6号样本经2、8、16、64、128、256、512倍稀释后, 盐水法均不凝集。观察凝聚胺法、木瓜酶法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法4种方法, 2倍(2、3号管)、8倍(3、5、6号管)、16倍(1、2号管)、64倍(2、6号管)、128倍(2、6号管)木瓜酶法凝集均弱于其他3种方法。抗人球蛋白法和凝聚胺法在各个稀释度下凝集程度相似。微柱凝胶法凝集最强(5号管16、256倍稀释时)。根据凝集强度对不同稀释比例进行计分, 盐水法得分:0、0、0、0、0、0、0; 凝聚胺法得分:34、25、14、7、3、1、0; 木瓜酶法得分:32、20、10、6、2、0、0; 抗人球蛋白法得分:38、25、14、8、4、0、0; 微柱凝胶法得分:38、26、16、9、6、2、0。见图1(a)。

图1 不同方法检测不同稀释度IgG抗体凝集强度比较

三、5种方法红细胞凝集强度的相关性分析

凝聚胺法与木瓜酶法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法的相关系数(r)分别为0.993 2、0.996 5、0.996 7, 木瓜酶法与抗人球蛋白法、微柱凝胶法的r分别为0.998 1、0.994 0, 抗人球蛋白法与微柱凝胶法的r为0.998 3。凝聚胺法、木瓜酶法、抗人球蛋白法和微柱凝胶4种方法的得分经SPSS10.0的χ 2检验, 4种方法间差异无统计学意义(P> 0.05)。见图1(b)。

讨 论

随着输血技术的发展, 各种新方法不断涌现, 试剂灵敏度也在不断提高, 使得血型鉴定误差引起的速发性溶血性输血反应发生率显著减少, 然而患者由于输血或妊娠产生的免疫抗体引起迟发性溶血反应却时有发生[4~5]。临床输血前的采供血机构献血者、受血者及孕妇产前进行血型不规则抗体筛查非常必要, 以避免不规则抗体引起交叉配血困难、新生儿溶血病、溶血性输血反应[1~5]。虽然不规则抗体在国内正常人群中检出率仅为0.3%~2.0%, 但如果不检测或者漏检对患者就有着致命的危险性, 尤其是有输血史和妊娠史的患者。因此, 有必要对临床输血和产前检查的方法进行合理评价, 为各级医院、血站筛选方便、实用、准确率高的方法来检测不规则抗体。

临床交叉配血方法有盐水法、凝聚胺法、木瓜酶法、抗人球蛋白法和微柱凝胶法等, 方法各有优缺点。

临床常规用盐水法进行交叉配血, 但仅检出IgM型的完全抗体, 存在IgG型抗体漏检的风险, 因而存在着一定的输血反应的危险[4]。

凝聚胺试验是在LIM下多聚季氨盐促使红细胞产生非特异性凝集反应, 具有灵敏度高、价廉、快速、操作简便等优点, 能检出IgM和IgG抗体, 目前已作为常规筛选试验应用于血型鉴定、交叉配血、不完全抗体的筛选[6, 7]。但凝聚胺法在临床应用中也存在一定的局限性[7, 9], 如对操作者要求较高, 必须正确振摇细胞扣, 严格按照规定时间判定结果。对有些低浓度抗体易漏检, 敏感性较低, 如抗-JKa抗体[4]。肝素样本对凝聚胺试验易造成干扰, 原因是带有高价的负离子肝素可以中和凝聚胺的正电荷, 使红细胞之间非特异性反应减弱。凝聚胺和Kell系统抗原都带正电荷, 故不能用于抗-K抗体的检出。

酶技术对Rh和Kidd血型系统的抗原可以进行修饰, 在检测这类抗体时较为敏感, 能检出多种性质的IgG抗体, 但酶可以破坏红细胞膜上的MNSs、Duffy系统抗原, 会造成抗-M、N、S、s、Fya、Fyb等抗体漏检。酶试剂易失活, 不易保存。酶技术应用过程中会受唯酶抗体的干扰。

抗人球蛋白是在IgG抗体之间起到桥梁作用, 使致敏了IgG抗体的红细胞表现出凝集, 具敏感性高, 特异性强, 是世界公认检测红细胞不规则抗体的经典方法。但该法存在着操作繁琐、工作量大、孵育时间太长、洗涤红细胞繁琐等缺陷, 所以不适于常规的不规则抗体筛选及急诊配血, 限制了其在血型血清学方面的应用[7]。

微柱凝胶技术是在Coom’ s原理基础上改良的新技术, 已应用于血站和临床大中型血库, 有效地进行IgG抗体筛选和鉴定、血型定型、交叉配血等。由于加入的红细胞量多于血清量, 离心时致敏了IgG抗体的红细胞首先与抗人球蛋白反应[10, 11] , 避免了过多血清抗体中和抗人球蛋白试剂, 实验中勿需洗涤红细胞, 操作简便, 大大减化了实验工序, 避免了不同操作者带来的误差, 其灵敏度高于传统试管抗人球蛋白法[10, 11]。该法重复性好, 易自动化和标准化, 结果可长期保存。因此微柱凝胶法检测红细胞IgG抗体具有良好的应用前景[10~12]。但该方法对样本要求高, 制备的红细胞悬液浓度不能超过1%, 若混有小凝块时易出现假阳性, 因其需使用专用仪器且价格较贵, 所以在临床推广应用较慢。

表1和图1(a)显示, 盐水法只能检出IgM类的不规则抗体, 木瓜酶法在检测IgG抗体效价时敏感性略低, 抗人球蛋白法和凝聚胺法敏感性相似, 微柱凝胶法最为敏感。图1(b)显示, 凝聚胺法、木瓜酶法、抗人球法和微柱凝胶4种方法的r很好, 方法间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。提示在产前检查和交叉配血试验中, 若存在的红细胞IgG抗体效价和/或亲合力较低、或其相应的抗原在红细胞上存在的剂量较低, 若单纯使用一种方法, 如木瓜酶法存在IgG抗体漏检的可能性[6]。鉴于上述方法的优缺点, 我们建议对临床高度怀疑可能存在不规则抗体的标本, 先通过盐水试验检测有无IgM类的抗体, 经济条件较好的实验室最好选用微柱凝胶法, 基层实验室可采用抗人球蛋白法再结合一种方法进行不规则抗体筛选与鉴定, 以防止有临床意义的IgG抗体的漏检[6], 尽可能降低或避免迟发性溶血性输血反应和新生儿溶血病的发生。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Watchko JF. Identification of neonates at risk for hazar-dous hyperbilirubinemia: emerging clinical insights[J]. Pediatr Clin North Am, 2009, 56(3): 671-687. [本文引用:2]
[2] Koelewijn JM, Vrijkotte TG, Van der Schoot CE, et al. Effect of screening for red cell antibodies, other than anti-D, to detect hemolytic disease of the fetus and newborn: a population study in the Netherland s[J]. Transfusion, 2008, 48(5): 941-952. [本文引用:1]
[3] Koelewijn JM, Vrijkotte TG, De Haas M, et al. Risk factors for the presence of non-rhesus D red blood cell antibodies in pregnancy[J]. BJOG, 2009, 116(5): 655-664. [本文引用:1]
[4] 张晨光, 吴子钊, 胡志军, 等. 抗-Jka致溶血性输血反应结果分析[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(3): 570-571. [本文引用:4]
[5] 张晨光, 贺志安, 赵庆伟, 等. Rh血型系统不规则抗体与新生儿溶血病的相关性[J]. 现代预防医学, 2007, 34(11): 2036-2038. [本文引用:3]
[6] 罗志, 李聚林, 孔庆芳, 等. 4种交叉配血方法的试验效果比较[J]. 中国输血杂志, 2009, 22(1): 36-37. [本文引用:3]
[7] 孙爱农, 许惠根, 吴晓燕, 等. 三种红细胞不规则抗体筛选试验方法的比较[J]. 检验医学, 2007, 22(1): 71-74. [本文引用:4]
[8] 叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 246-246.
[9 Liu F, Hu LH. Serum protein media are important factors in the manual hexadimethrine bromide (polybrene) test, experience in China[J]. Transfus Clin Biol, 2005, 12(1): 34-37. [本文引用:1]
[10] 张军, 管政, 周浩, 等. 微柱凝胶技术与传统试管法检测孕妇IgG抗-A(B)效价[J]. 中国输血杂志, 2008, 21(12): 948-949. [本文引用:3]
[11] 刘晗, 李彤彤, 李浩泷. 传统试管法与微柱凝胶技术检测新生儿溶血病的比较[J]. 临床输血与检验, 2008, 10(3): 266-267. [本文引用:2]
[12] 张健, 董建红, 孙佰秀, 等. 微柱凝胶法检测1 610例O型血孕妇IgG抗体效价的研究[J]. 中国优生与遗传杂志, 2008, 16(2): 67. [本文引用:1]