引用本文
徐雪琴, 谢丙乐, 胡速, 林晓玲, 郑昭科, 谢番妮, 吴昊, 李德柒, 唐少华. 荧光原位杂交技术快速诊断胎儿常见染色体数目异常[J].检验医学, 2015,25(12): 921-924
XU Xueqin, XIE Bingle, HU Su, LIN Xiaoling, ZHENG Zhaoke, XIE Fanni, WU Hao, LI Deqi, TANG Shaohua. Rapid prenatal diagnosis for fetal chromosome abnormality by fluorescence in situ hybridization[J]. Labratory Medicine, 2015,25(12): 921-924  
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荧光原位杂交技术快速诊断胎儿常见染色体数目异常
徐雪琴, 谢丙乐, 胡速, 林晓玲, 郑昭科, 谢番妮, 吴昊, 李德柒, 唐少华
温州医学院定理临床学院 温州市第二人民医院检验科,浙江 温州 325000

作者简介:徐雪琴,女,1980年生,学士,主管技师,主要从事产前诊断和产前筛查工作。

通讯作者:唐少华,联系电话:0577-88070197。

基金:卫生部科研基金合作项目(No.WKJ2007-3-001)
摘要
目的 探讨荧光原位杂交(FISH)技术在产前诊断中的应用价值。方法 采集116名孕妇孕16~23周的羊水标本,应用荧光标记的21号染色体特殊位点探针(21q22,DSCR2)、13号染色体特殊位点探针(13q14,DLEU1)及18号染色体探针、X/Y染色体着丝粒探针(CEP)对未经培养的羊水间期细胞进行FISH检测;同步进行羊水细胞培养,行常规细胞遗传学染色体核型分析。结果 FISH与羊水细胞核型分析相符的染色体数目正常108例,数目异常6例,另各有1例染色体核型分析分别显示为平衡易位、臂内倒位异常,FISH结果显示正常。6例数目异常胎儿引产时抽脐血染色体检查结果与羊水产前诊断结果一致。结论 FISH技术用于快速诊断胎儿常见染色体数目异常,具有简便、快速、特异性强等优点,临床有较高的应用价值。
关键词: 荧光原位杂交; 染色体; 产前诊断; 羊水
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)12-0921-04
Rapid prenatal diagnosis for fetal chromosome abnormality by fluorescence in situ hybridization
XU Xueqin, XIE Bingle, HU Su, LIN Xiaoling, ZHENG Zhaoke, XIE Fanni, WU Hao, LI Deqi, TANG Shaohua
Department of Clinical Laboratory, the Ding-Li Clinical Medical School of Wenzhou Medical College, the Second People's Hospital of Wenzhou, Zhejiang Wenzhou 325000, China
Abstract
Objective To investigate the clinical value of fluorescence in situ hybridization (FISH) in prenatal diagnosis.Methods The uncultured amniotic fluid from 116 pregnant women with 16-23 gestational weeks were detected by FISH using chromosome-specific DNA probes of 13 (13q14, DLEU1), 18, 21(21q22, DSCR2), X and Y-chromosomes [centro mere probe (CEP)]. The routine analysis of amniotic cell chromosome karyotypes was also performed simultaneously.Results Normal chromosome karyotypes were shown in 108 cases, and chromosome abnormality was found in 6 cases by FISH, respectively. These results were consistent with those by routine analysis of amniotic cell chromosome karyotypes. The chromosome karyotypes of balance transposal (1 case) and inner inverse abnormity (1 case) were found. The FISH results showed normal.Conclusions FISH for prenatal diagnosis showes simple, rapid and high specific characters,and is valuable for the clinical diagnosis.
Keyword: Fluorescence in situ hybridization; Chromosome; Prenatal diagnosis; Amniotic fluid

染色体数目异常是引起新生儿先天性遗传病的主要因素之一。传统的羊水细胞培养、染色体核型分析是宫内产前诊断胎儿染色体疾病的主要方法, 但该方法所需时间长、技术难度大、易受培养条件的影响。对未经培养的羊水间期细胞进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 检测, 快速诊断胎儿常见的三体型及性染色体数目异常, 具有快速、简便、敏感和特异性强等优点[1~3]。我们应用13、21和18、X、Y 2组染色体探针对116例有产前诊断指征孕妇的羊水细胞同时进行FISH检测及常规核型分析, 以评价其临床应用价值。

材料和方法
一、研究对象

2008年2月至2009年3月, 对温州地区各大医院血清学二联筛查(甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素β 亚单位)高风险、超声诊断异常(胎儿颈部透明带增厚、胎儿心脏异常)及孕妇年龄高风险和有不良妊娠史的高危孕妇116例进行产前诊断, 年龄21~44岁, 孕龄16~23周。

二、研究方法

1.羊水标本采集 在B超腹部探头引导下行羊膜腔穿刺, 抽取羊水25~30 mL。其中约20 mL用于常规羊水细胞培养, 约5 mL用于FISH检测。

2.羊水间期核细胞制备 5 mL羊水离心弃上清液, 加胶原B 3~5 mL吹打混匀37 ℃作用20~25 min, 加入5 mL 37 ℃预温的0.075 mmol/L氯化钾溶液低渗20 min后, 甲醇∶ 冰乙酸(3∶ 1)混合液2 mL预固定, 1 500 r/min(离心半径20 cm)离心10 min, 弃上清, 加5 mL固定液作用10 min, 1 500 r/min(离心半径20 cm)离心10 min, 重复固定1次, 制备细胞悬液, 空气干燥法制片, 划定杂交区域。

3.羊水细胞核型分析 按文献方法进行羊水细胞培养、染色体制备, G显带, 参照ISCN(1995)标准进行核型分析。

4.FISH检测 (1)探针选择:13、21位点探针和18、X、Y染色体着丝粒探针(北京金菩嘉公司提供), 着丝粒探针域定位于p11.1~q11.1, 探针分别以FITC(绿色)和Rhoda mine(红色)直接标记; 13、21染色体单一序列探针, 区域定位于13q14、21q22, 分别以FITC(绿色)、Rhoda mine(红色)直接标记; (2)按试剂盒提供的荧光原位杂交操作说明进行标本处理、变性、杂交、杂交后洗涤等操作。在OLYMPUS BX51荧光显微镜下观察杂交信号, 用美国维士荧光图像处理系统进行图像分析, 每组探针随机计数100个间期细胞(不包括相互之间重叠及斑片状或弥散状杂交信号的细胞核), 并记录与探针相应的杂交信号。

三、统计学方法

结果数据用SPSS10统计软件进行统计处理。

结 果
一、FISH杂交结果与其染色体核型G显带分析结果比较

对116例具有产前诊断指针的孕妇羊水间期细胞进行FISH检测; 同步进行羊水细胞培养, 行常规细胞遗传学染色体核型分析。FISH结果显示正常110例, 而核型分析结果显示正常108例, 其中各有1例染色体核型分析分别显示为平衡易位46, XX, t(5; 18)(q24; q22)、臂间倒位46, XX, inv(9)(p11; q11), FISH结果显示正常; 6例数目异常分别为21-三体4例、18-三体1例、Turner 1例, FISH和核型分析结果完全符合, 2种方法符合率达98.3%。GLP13/21探针组13号特异性位点探针显示绿色, 21号特异性位点探针显示红色, 若显示2个绿色信号和3个红色信号, 提示3条21号染色体存在。CSP18、X和Y探针组18号探针显示天蓝色, X着丝粒探针显示绿色, Y探针显示红色, 若显示2个绿色信号, 提示2条X染色体存在; 显示1个绿色信号和1个红色信号, 提示X、Y染色体存在; 仅显示1个绿色信号, 未见红色信号, 提示1条X染色体存在; 显示3个天蓝色信号提示3条18号染色体存在。见表1和图1、2 。

表1 8例异常核型及其FISH结果

图1 6种病例的染色体核型图

图2 6种病例的FISH结果图

二、平衡易位

平衡易位[8]是染色体异常中较为常见的一种, 是染色体结构重组, 基本不涉及遗传物质的丢失, 故携带者表型正常, 临床体格检查无阳性体征。本研究中1例核型为46, XX, t(5; 18)(q24; q22), 而FISH显示2个天蓝色信号, 其结果正常, 两者不相符。可见, FISH技术不能检出染色体结构异常, 只有通过细胞遗传学染色体核型分析才能得到正确合理的解释。

三、 随访结果

对产前诊断正常的妊娠妇女进行追踪随访至分娩, 新生儿全部表型正常无畸形。对于6例数目异常胎儿引产时抽脐血染色体检查结果与羊水产前诊断结果一致。1例平衡易位和1例臂内倒位的妊娠妇女进行追踪随访至分娩, 新生儿表型正常无畸形。

讨 论

FISH技术作为一门新兴的分子细胞学遗传技术, 已经广泛应用于分子细胞遗传学检测、间期细胞遗传学分析以及DNA片段的染色体定位等研究中, 推动了临床细胞遗传学的发展。随着细胞遗传学研究技术的不断深入, 目前FISH技术在产前诊断、植入前遗传学诊断、妇科肿瘤相关基因诊断和分析中展现出更加广阔的应用前景。随着人类基因组信息不断的完善, 将FISH技术与不断完善的人类基因组序列信息结合起来, 必能进一步识别分裂中期细胞未知标记的染色体, 辨别复杂的染色体结构, 在产前诊断、植入前遗传学诊断中发挥重要的作用, 达到优生优育的目的。本研究利用产前诊断探针(CSP18/CSPX/CSPY DNA探针和GLP 13/GLP 21 DNA探针)对未经培养的116例羊水间期细胞进行FISH检测; 同步进行羊水细胞培养, 行常规细胞遗传学染色体核型分析。61例羊水细胞FISH结果显示女性, 47例FISH结果显示男性, 与羊水细胞培养后染色体核型分析一致; 用CSP X/Y探针进行FISH检测, 结果出现2个绿色信号提示为女性胎儿[图1(a)、图2(a)], 1个色荧光信号和1个橘红色荧光信号, 提示为男性胎儿[图1(b)、图2(b)]。1例羊水标本FISH结果提示性染色体为1条X, 并从染色体核型分析结果得到证实[图1(c)、图2(c)]; 用GLP13/21探针检测, 结果4例羊水标本96%以上的间期细胞核出现3个橘红色21号探针信号, FISH结果提示21-三体[4], 羊水培养和终止妊娠后脐血培养结果证实为21-三体患儿[图1(d)、图2(d)], 1例羊水标本FISH结果显示3个明亮的天蓝色18号探针信号, 提示18-三体, 同样在羊水和脐血培养后得到证实[图1(e)、图2(e)]; 1例羊水标本FISH结果未显示异常, 而染色体核型分析显示46, XX, inv(9)(p11; q11); 1例羊水标本FISH结果显示2个明亮的天蓝色信号, 提示18号染色体2条, 而染色体核型分析显示46, XX, t(5; 18)(q24; q22), 产后随访行小儿外周血染色体培养得到证实。以上结果提示染色体核型分析是检测染色体异常的传统方法, 具有极高的准确性。但该技术具有一定的局限性, 如取材时间有限、细胞培养耗时长、有可能发生污染导致培养失败、结果取决于细胞核中期分裂相的数量与质量、需人工镜下分析、对技术人员的技术水平要求较高。FISH技术应用于产前诊断具有多方面的优势, 最突出的优点是快速、准确, 在观察结果的时候仅需进行细胞计数、辨认杂交信号的有无与多少, 不易发生漏看或错看的问题, FISH技术适用于细胞周期的所有阶段, 未经培养羊水间期细胞FISH分析可于妊娠16周后的任何时间取材, 并于羊膜腔穿刺后24~48 h内确定胎儿非整倍体染色体异常[5, 6]。同时杂交过程应严格控制温度, 操作迅速, 注意避光, 因此杂交仪、恒温箱和暗室是必需的设备。在以上成熟条件下, 再加经过严格培训的技术人员, 保证实验稳定、准确, 方可用于临床, 可快速诊断胎儿常见染色体数目异常, 但一种DNA探针只能检出一个相应的DNA序列。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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