人全血中的血红蛋白由HbA(95%~97%)、HbA2(2.5%~3%)、HbF(0.5%~1%)组成。HbA中约90%为非糖化血红蛋白(HbA0), 5%~8%为糖化血红蛋白(HbA1)。HbA1由与果糖-1, 6-二磷酸结合的HbA1a1(1.6%)、与葡萄糖-6-磷酸结合的HbA1a2(0.8%)、与其他碳水化合物结合的HbA1b和与葡萄糖结合的HbA1c(5%)4种成分组成。

目前, 根据国际临床化学协会(IFCC)命名、特性和单位委员会(C-NPU)公布的定义:HbA1c化学结构通常为具有一个特定六肽的血红蛋白分子, 是葡萄糖和血红蛋白β 链N末端缬氨酸(Val)(β N-1-去氧果糖基血红蛋白)的一个稳定加合物^[3]。在人体内, 葡萄糖和血红蛋白β 链N末端Val氨基之间进行非酶促反应, 先形成不稳定的希夫碱(Schiff base), 然后缓慢地重排, 形成稳定、不可逆的氨基酮。因为HbA1c与红细胞的生存期有关, 其合成速率与平均120 d生命周期的红细胞糖化量成正比函数关系。临床上HbA1c代表了最近2~3月平均血糖的控制水平。由于HbA1c是非均一的物质, 可与葡萄糖结合的位点有β -N-Val-1(IFCC定义的HbA1c化学结构)、α -赖氨酸(Lys)-16、β -Lys-66、β -Lys-17、α -N-Val-1、α -Lys-7和β -Lys-120。现有的各种检测方法根据可捕捉的物质不同, 其被测量也不同。因此, 对HbA1c分析物的定义极其依赖于检测的方法原理。

1. 离子交换层析法 基于电荷差异进行分析。葡萄糖与血红蛋白的β 链N末端Val连接降低了等电点, 导致HbA1c带的正电荷比未糖化血红蛋白的少, 与树脂的附着力小。可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将血红蛋白从阳离子交换柱中洗脱下来, 再根据每个峰值下的面积来计算HbA1c占总血红蛋白的比例。但是该方法中血红蛋白变异体会随HbA1c一起洗脱, 影响HbA1c 值。该方法最早由Trivelli等^[4]于1971年首次将微柱法用于临床, 但重复使用率低, 受温度、pH值影响 ^[5], 受血脂、Schiff base、胆红素干扰^[6]。经过多年在技术上的不断完善, 检测精密度有了明显的提高, 有些产品变异系数(CV)< 1%, 但是非特异性问题仍存在, 有些产品仍会受血红蛋白变异体、氨基甲酰化和乙酰化血红蛋白的影响。目前临床上已采用高通量的高效液相色谱(HPLC)和低压系统HPLC方法。美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的参考实验室也是使用Bio-Rex70 阳离子交换树脂HPLC作为参考方法。

2. 电泳法 是上世纪80年代出现的, 与离子交换层析法一样也是基于糖化和非糖化血红蛋白所带的电荷不同进行分离^[7]。该方法操作简易, 不受温度、pH影响。在当时相对其他方法来说精密度较高, 但是需成批样本分析, 分析时间较长, 临床上现已较少使用。

3. 亲和层析法 基于结构不同进行分析。最早是由Mallia等^[8]于1981年研发的。该方法利用对m-氨苯基硼酸依赖的糖化血红蛋白1, 2-顺式二醇基团和固定的硼酸阴离子的特殊反应而设计的。与血红蛋白α 和β 链的Val和e-Lys连接的葡萄糖均会与硼酸结合形成可逆的复合物, 未糖化血红蛋白先被洗脱后, 再用山梨醇分离复合物, 并将全部糖化血红蛋白洗脱出来。检测结果是“ 总” 糖化血红蛋白, 通过校准其结果与HPLC有良好的相关性。该方法不受温度^[9]、尿毒症、HbF或Schiff base的干扰, 同一实验室的精密度较高, 而实验室间的结果存在差异^[10]。

4. 免疫法 早在1978年就有文献^[11]介绍, 但由于当时的技术局限直至10年后才有商业化产品。单克隆抗体技术的运用使该方法有了快速发展, 最早是英国Dako公司研制出识别葡萄糖附着在血红蛋白的β 链N末端8个氨基酸抗原位点的单克隆抗体, 用酶免疫(EIA)原理进行检测。该抗原与IFCC参考系统用于制备一级参考物质的β 链N末端6个氨基酸肽端极为相似, 其参考范围(2.8%~4.9%)比其他方法更低, 而与IFCC推荐的(2.85%~3.81%)更为一致。该方法具有良好的精密度及其与其他方法良好的相关性^[12]。但是, 当血红蛋白发生第6位氨基酸变异[HbS(β ^{6Glu→ Val})和HbC(β ^{6Glu→ Lys})]时将不会被识别。有研究对此变异进行实验, 结果显示厂家间的检测结果存在着偏倚^[13]。目前, 可以在自动生化仪上用比浊法进行定量测定, 由于各厂家产品的单抗针对的抗原决定簇不同、亲和力不同等因素将会影响结果的可比性。

5. 酶法 是近几年才推出在自动生化仪上测定的方法。其原理是在蛋白酶的作用下, 切断HbA1c的β 链N末端的糖化二肽, 糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成过氧化氢, 在过氧化物酶的存在下与显色剂产生显色反应, 通过测定吸光度值求出HbA1c的百分浓度。该方法精密度好, 与HPLC和免疫法均有良好的相关性。

6. 即时检验(POCT) 目前, 在国内使用较多的有2种方法, 一种是利用硼酸亲和原理在颜色反射计上进行HbA1c快速检测。HbA1c特异地与硼酸复合物结合呈蓝色, 而未糖化血红蛋白呈红色, 通过两者光强度的比例计算出HbA1c的百分浓度。另一种是基于免疫反应原理在荧光分析仪上检测含HbA1c的荧光染料分子的斑点数, 换算成HbA1c的百分浓度。POCT检测HbA1c具有便携、速度快的优点, 但是精密度和准确度相对其他方法要差, 且对样本中血红蛋白量有较大限制。最新报道^[14]了8款采用POCT方法检测HbA1c的产品, 仅2款通过了NGSP评价。

综上所述, 检测HbA1c的方法涉及层析技术、电泳技术、免疫技术、生化(酶学)技术、快速检测技术, 所有方法的被分析物HbA1c都是自我定义的, 而实际HbA1c值是不同的。由于受各种干扰, 如:红细胞生存期的改变、异常血红蛋白、黄疸和高脂血症、乙酰化血红蛋白、氨基甲酰化血红蛋白等因素均可造成HbA1c值出现假性升高或降低, 所有检测方法都存在非特异性, 且影响到采用HbA1c值评估患者平均血糖浓度的准确性。因此, HbA1c检测的标准化和质量管理显得尤为重要。

1993年美国临床化学协会(AACC)建立的NGSP^[15]和1995年IFCC建立的国际糖化血红蛋白标准化计划对规范HbA1c检测质量卓有成效。前者通过参考实验室网络(包括核心、中心、一级和二级实验室)的样本比对来降低室间差异, 要求检测实验室应参加能力比对试验。实验室采用可溯源到DCCT参考物的方法, 使报告的结果都能溯源到DCCT结果。每次检测同时测2个不同值的质控样本, 测定结果以HbA1c形式报告, 建议检测的批内CV应< 5%, 最理想为< 3%^[16]。标准化工作的成绩是显著的, 最近有专家提出HPLC的批内精密度最佳目标可提高到2%, 批间精密度为3.3%^[17]。美国临床病理协会(CAP)的可接受标准也在逐年提高, 2008年为 NGSP靶值± 12%; 2009年提高为± 10%; 2010年要求达到± 8%^[18]。IFCC则致力于建立HbA1c检测的参考系统(包括参考方法^[19]、参考物质^[20]和参考实验室网络)。在其建立的实验室网络中, 用其研发的纯度达98%的HbA1c和HbA0进行校准, 用其推荐的高效液相/电雾化质谱(HPLC-MS)或高效液相/毛细管电泳(HPLC-CE)参考方法检测。其结果室内CV为0.47%~2.07%; 室间CV为1.35%~2.27%。并建立与NGSP网络结果间的联系, 与NGSP联合推进HbA1c标准化工作, 欲使各种方法结果具有可比性。同时, IFCC参考方法与NGSP、日本糖尿病协会/日本临床化学协会(JDS/JSCC)和瑞典制定的国家参考体系进行了HbA1c方法学比对研究, 并建立了相关性的线性回归模型加以阐述^[21], 该结果在经过了6年的跟踪研究后被证明是稳定和可靠的^[22]。

上海市临床检验中心对本地区临床实验室的HbA1c检测质量管理始于2006年底, 主要从二方面着手同时进行。一是开展全市临床实验室HbA1c检测的质量管理包括室间调查、人员培训和选择合适的室内质控样本等; 二是建立IFCC推荐的参考方法(HPLC-CE)。

上海地区临床实验室HbA1c的检测方法主要有高效液相、低压液相、亲和层析、免疫法、酶法、快速法(微粒法、免疫荧光法)和电泳, 涉及30多个产品, 2007年第1次的调查结果显示, HbA1c值约为6%的样本, 层析法、免疫法和快速法的室间CV分别达9.4%(n=40)、19.8%(n=12)和8.1%(n=38), 情况令人担忧。为提高质量, 我们加大了实验室工作人员HbA1c相关的基础理论知识的培训力度, 建立检测的标准操作规程规范实验操作, 增强质控意识, 规范质控品的使用、贮存, 了解质控规则、正确判断质控结果, 对失控情况的处理等一系列措施。

同时, 选择合适的室内质控样本用于地区性质量控制。由于HbA1c检测的复杂性, 需对质控品进行综合性能评价, 内容包括为消除质控品的基质效应问题选择近似人血基质的样本; 正常和异常2个水平的浓度; 为消除瓶间差引入的不精密度尽量选择液体质控品, 也方便操作者使用; 质控品开瓶后的稳定期要较长; 价格要适宜; 最为关键的是针对HbA1c的检测特点, 选择的质控品尽可能适用于多种检测方法。根据上述要求, 我们从候选的5种品牌质控品中, 选择的质控品用HPLC检测2个浓度为5.5%和12.6%, 其CV分别为1.6%和2.6%(70 d, 2~8 ℃贮存)。

进一步的工作是在上海市临床实验室质量管理基本内容和要求— — 上海市《医疗机构临床实验室管理办法》实施细则中, 对HbA1c检测项目明确了具体的质量管理要求。开展HbA1c项目的临床实验室应编写相应的操作规程、质控规程, 每星期至少做1次正常和异常值的室内质控, 质控结果输入质控软件进行质控结果的判断, 对失控的情况应加以分析与纠正, 每月汇总结果上报至上海市临床检验中心, 每年参加2次室间质评。2008年和2009年HbA1c室间评价标准暂定为组均值± 20%。根据实际情况, 地区性质控的质控频次和评价标准也将逐年提高, 2010年HbA1c室内质控为每个工作日用2个浓度质控, 室间质评标准提高到组均值± 15%。

2009年第2次室间质评结果显示, HbA1c值约为5.5%的样本, 层析法(n=121)的CV为5.0%; 免疫法(n=24)为6.4%; 快速法(n=19)为9.6%。从调查结果可以看到, 经过规范管理, 全市临床实验室的HbA1c的检测质量有了一定的改进。但是, 这个结果离国际水平差距甚远。对比2008年美国CAP公布的HbA1c调查结果, 其检测均值与NGSP 的HbA1c低、中、高靶值的差异分别为0.3%、0.6%和0.9%; 超过90%实验室方法之间的差异≤ 0.5%^[18]。由此可见, 我们在HbA1c的质量管理上尚有许多工作要做。

着眼于未来, 建立参考方法、制备参考物质、建成参考实验室网络, 是实现我国HbA1c检测溯源性的必由之路, 对临床实验室间的检测结果的准确性和可比性意义重大。我们希望通过中国HbA1c教育计划推动HbA1c标准化和质量管理的进一步深入开展, 为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效观察提供准确、有效的检测结果, 从而更好地服务于临床和糖尿病患者。