目前国内外检测尿微量白蛋白主要应用免疫化学的方法, 包括放射免疫法、免疫比浊法(散射比浊和透射比浊)、化学发光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、试纸条半定量法, 免疫荧光法, 免疫胶乳凝集试验等。每种方法各有其利弊。

放射免疫法(RIA)是以放射性核素作为标记物的标记免疫分析法, 用于定量测定受检样本中的抗原, 是公认的测定尿微量白蛋白的最好方法, 在我国自70年代初即开始应用。此方法灵敏度高(可高达ng甚至pg水平), 准确性良好, 特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定, 曾作为检测尿微量白蛋白的金标准。但其存在放射性防护和同位素污染的问题, 况且试剂只有一定时间的保质期, 且价格昂贵。此外, 线性范围较小, 高浓度样本需稀释重做, 较费时费力, 所以在基层医疗机构难以普及。

化学发光免疫分析法(CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的检测方法。近10年来发展迅猛, 是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法之一。其灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高出几个数量级, 且特异性强、试剂稳定(有效期6~18个月)、价格低廉, 线性范围宽(一般达5~6个数量级), 检出限可以达10~15 mg/L, 操作简单, 分析速度快, 易实现自动化, 且没有污染问题。目前微粒子化学发光检测技术已被广大检验人员及临床医生所认可, 越来越多的临床检验项目选择使用微粒子化学发光法检测。但临床上应用该法检测尿微量白蛋白的试剂及仪器皆依赖于进口。目前只有西门子诊断immulite化学发光分析仪可以进行尿微量白蛋白检测, 因此应用并不普遍。

ELISA是以免疫学反应为基础, 将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。ELISA以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的肯定。有研究表示, ELISA测定尿微量白蛋白与放射免疫法及化学发光法比较, 有良好的相关性^[4]。但ELISA操作中的各个环节对试验的检测结果影响较大, 包括选择试剂以及加样、孵育、洗板、显色、终止、读板过程中的操作, 每个细节的操作不当, 均有可能导致显色不全、花板等结果。故此方法重复性较差, 易出现假阳性和假阴性。有些实验室为降低成本而自行开发试剂盒, 但其特异性、敏感性及稳定性尚待评价。

免疫比浊法(ITM)以抗原抗体反应的原理为基础。透射比浊与散射比浊是免疫比浊常见的2种方法, 目前使用较为普遍。二者反应的原理一样, 只是检测的光信号与仪器的检测器有区别。透射比浊法是目前检测尿微量白蛋白较普遍的方法, 其操作简便, 适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计, 几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和准确度均较散射比浊法低^[5], 所需的抗血清量大。散射比浊法的灵敏度、精密度均较高, 检测快速, 但需特定的分析仪器(特定蛋白分析仪)。总体来说, ITM准确度和灵敏度均较好, 线性范围较广, 可达到200 mg/L, 且重复性好, 干扰因素少, 快速简便。但将ITM作为检测尿微量白蛋白的参考方法, 在有些文献中并未得到赞同, 其认为抗体在不同的检测程序中可能会与白蛋白分子或分子片段上的不同表位反应, 并且不同的检测原理会有不同的反应^[4], 可能无法保证检测的准确性。

试纸半定量法普遍用于尿微量白蛋白筛查。该方法快速、简便, 但检测的灵敏度有待提高, 其结果仅作参考, 若检测阳性, 仍需进一步确证^[6]。

目前检测尿微量白蛋白的方法还有免疫荧光法、免疫胶乳凝集试验等方法, 但临床使用较少。临床常用检测尿微量白蛋白的方法还有尿蛋白电泳法, 在检出蛋白的同时能正确的反映尿液内各蛋白组分的含量及变化, 对临床医生判断患者肾损伤状况有重要参考意义, 对糖尿病肾病的早期诊断、鉴别诊断、指导治疗具有较大价值。

高效液相色谱法(HPLC)近年来逐渐成为尿微量白蛋白检测方法的研究热点。HPLC是在经典液相色谱法的基础上, 于60年代后期引入了气相色谱理论和实验技术而迅速发展起来的现代液相色谱分析方法, 具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。其最大的特点是可以检测出患者尿液中免疫化学非反应性白蛋白(immunochemically nonreactive urinary albumin , INUA)和免疫化学反应性白蛋白总和的结果^[7]。尿液中的白蛋白可以多种形式存在, 因各种损伤改变分子构型而导致不能发生免疫反应的白蛋白就无法通过传统的免疫反应方法检测出来, 这些就是所谓的INUA。因此HPLC的检测结果要高于使用ITM检测的结果^{[7, 8]}, 并且部分使用ITM显示尿微量白蛋白正常时, 使用HPLC 检测时则显示已有尿微量白蛋白发生^[9]。Comper 等^[9]研究发现用HPLC来检测微量白蛋白, 可提前3.9年发现由1型糖尿病所致的糖尿病肾病, 发现2型糖尿病所致肾病可提前2.4年, 同时也证实INUA不存在于健康人群的尿液中。因此, HPLC检测尿微量白蛋白可以更早的提示患者出现的白蛋白尿, 更有利于早期的诊断和治疗。

1. 分析前影响因素 尿微量白蛋白分析前的影响因素有许多, 包括患者的健康情况、样本收集间隔的时间、尿液样本使用的类型(24 h尿、过夜尿、晨尿、随机尿)及尿液样本的分析前处理和保存等。其中样本的患者间生物变异越来越受到研究人员的关注。研究表明, 计算尿白蛋白/肌酐比值与其他得到尿白蛋白排泄率的方法比较, 其患者间生物变异在多个研究中均显示较低。过夜尿和晨尿样本尿白蛋白/肌酐比值的日间变异最低, 普遍低于尿白蛋白/肌酐比值的周间和月间变异^[10]。但在收集样本的时候仍要注意患者的自身状况, 包括运动、发烧、细菌感染、体位等。Jones^[11]对55家实验室进行调查。调查显示推荐的样本类型间及样本收集方法间有明显差异:包括24 h尿液收集、点时间尿样本、随机尿样本及首次晨尿样本的收集。国内也有研究显示各种尿液收集方法对尿微量白蛋白的诊断价值有一定差异, 晨尿和随机尿均不能代替24 h白蛋白排泄率。这与有些文献所述的不定时尿可代替24 h尿不一致, 所以还有待进一步研究。但可以确定的是, 晨尿要优于随机尿样本^[12]。关于尿液的保存, 近来的研究结果建议尿液样本保存于-80 ℃, 可长时间稳定。冰冻保存的温度高于-80 ℃, 尤其是高于-20 ℃, 会使白蛋白产生各种改变^[13], 但长期低温保存可导致尿微量白蛋白测定值下降^[6]。此外, 细菌、蛋白酶、沉淀物等因素会影响白蛋白尿的保存和检测, 这些还需在今后的研究中逐一解决。

2. 分析中影响因素 检测过程中血红蛋白和胆红素均会对尿微白蛋白测定产生负干扰, 并且干扰物浓度越高, 负干扰率也越大^[14]。尿液pH值^[15]、肾脏病变时尿中出现的其他蛋白成分也会影响检测结果, 故样本最好在30 min内检测完毕^[16]。

3. 结果报告 尿微量白蛋白的检测结果因检测方法不同而不同, 主要有:随机尿样本(最好是第1次晨尿)白蛋白 20~200 mg/L; 定时采集样本白蛋白排泄率0~200 μ g/min; 24 h 尿样本白蛋白排泄率30~300 mg/24 h^[17]。尿白蛋白/肌酐比值的结果报告单位分别有:(1)“ 毫克白蛋白每克肌酐” (mg/g)或“ 微克白蛋白每毫克肌酐” (μ g/mg); (2)“ 毫克白蛋白每毫摩尔肌酐” (mg/mmol)或“ 克白蛋白每摩尔肌酐” (g/mol)。常用临界值为30 mg/g(30 μ g/mg、3.4 mg/mmol或3.4 g/mol), 但不一定适用于所有年龄, 性别和种族的患者^[1]。《中国2型糖尿病防治指南》(2007版)推荐尿微量白蛋白参考范围为:男2.5~25.0 mg/mmol (22~220 mg/g)、女3.5~25.0 mg/mmol(31~220 mg/g)^[2]。有学者^{[17, 18]}对欧洲10个国家及澳大利亚的2 000多名医师进行的相关调查问卷显示目前尿白蛋白的检测比较混乱。在不同的国家, 普遍应用的检测不同, 包括许多不同系统。定时样本仅在一些国家中广泛应用, 许多内科医生也并没有通过重复试验确证去得到一个确定的检测结果, 并且无论使用随机尿, 点时间尿或晨尿都存在显著变异。此外, 大约30%的内科医生没有去考虑检测值变化所对应的临床重要改变, 而对其余70%的内科医生来说, 他们视为有意义的检测值差异包括很大的范围, 且引用不同的百分数表示增长或减低的变化。同时, 除荷兰以外的所有国家, 报道尿白蛋白结果时有4种不同方法:浓度(mg/L)、24 h排泄率(mg/24 h)、每分排泄率(μ g/min)和尿白蛋白/肌酐比值(mg/mmol或mg/g)。实验室报告的生物参考区间主要根据检测仪器和试剂的参考范围决定, 从尿白蛋白15~30 mg/L和尿白蛋白/肌酐比值1.0~3.6 mg/mmol(或9~32 mg/g)不等^[10]。白蛋白排泄与肾脏和心血管疾病风险间增长的关系是持续的, 不能将尿白蛋白/肌酐比值中所有低于参考限的均视为正常。此外, 尿微量白蛋白检测不可一次定论, 初筛阳性者应确认3~6 个月内3 次收集尿样本, 其中至少有2 次不正常^{[2, 17, 19, 20]}, 同时还应考虑患者的自身影响因素后, 才可确诊。

4. 尿白蛋白检测的标准化 目前尿白蛋白检测没有标准化, 既没有一个参考物质也没有一种参考方法, 检验医学溯源联合委员会(the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, JCTLM)网站也没有列出尿白蛋白的高级参考物质或参考方法, 这会继续成为目前分析工作中所遇到的主要问题。无论是国外还是国内的调查, 均显示尿白蛋白检测有许多不同的检测系统, 但目前还没有一个公认的参考方法。同时, 白蛋白检测也需要一个参考物质。目前大多数常规方法被校准至可追溯到稀释CRM470(现在叫ERM-DA470, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium)^[10]。CRM470是一个血清白蛋白参考物, 白蛋白浓度为39.7 g/L。但CRM470毕竟是血清白蛋白的参考物, 血清基质与尿液的基质存在着重要区别。因此面对目前的状况, 急需一系列专门针对尿液白蛋白的参考方法及参考物质。