引用本文
王伟平, 闫李侠, 张仙森. 巢式PCR技术检测生殖道致病性支原体的临床应用[J].检验医学, 2015,25(11): 875-878
WANG Weiping, YAN Lixia, ZHANG Xiansen. Clinical application of nested PCR for the detection of infective mycoplasma in genitourinary tract[J]. Labratory Medicine, 2015,25(11): 875-878  
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巢式PCR技术检测生殖道致病性支原体的临床应用
王伟平, 闫李侠, 张仙森
温州医学院附属台州市第一人民医院检验科,浙江台州 318020

作者简介:王伟平,女,1977年生,学士,主管技师,主要从事临床微生物学与分子生物学检验工作。

通讯作者:张仙森,联系电话:0576-84287963。

摘要
目的 探讨巢式酶链聚合反应(PCR)技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体在临床上的应用。方法 以支原体16S~23S保守区域基因为扩增靶序列设计通用引物,采用巢式PCR方法扩增微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)4种支原体。结果 巢式PCR检测灵敏度高于一步PCR( χ2=5.857, P<0.05),巢式PCR扩增出4种支原体的标准株,对1份生物样品可同时检测出4种致病性支原体,避免了误诊、漏诊,提高诊治效率。结论 巢式PCR技术能快速、敏感、准确检测出Up、Uu、Mg和Mh引起的单一感染和混合感染,对于临床感染性尿道炎的早期诊断有重要意义。
关键词: 巢式聚合酶链反应; 致病性支原体; 生殖道
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)11-0875-04
Clinical application of nested PCR for the detection of infective mycoplasma in genitourinary tract
WANG Weiping, YAN Lixia, ZHANG Xiansen
Department of Clinical Laboratory, the First People's Hospital of Taizhou,Wenzhou Medical College,Zhejiang Taizhou 318020,China
Abstract
Objective To evaluate the clinical application of nested polymerase chain reaction (PCR) for the fast detection of infective mycoplasma in genitourinary tract.Methods The four mycoplasma ureaplasma parvum (Up), ureaplasma urealyticum (Uu), mycoplasma genitalium (Mg) and mycoplasma hominis (Mh) were amplified by nested PCR with consensus primer which was designed according to 16S-23S conservative region gene of mycoplasma.Results The sensitivity of nested PCR was higher than that of one step PCR (χ2=5.857, P<0.05), and four types of mycoplasma were amplified by nested PCR. Four mycoplasma can be detected in one biological specimen, without diagnostic errors and omission, and the diagnosis and treatment efficiency was improved.Conclusions Single infection and polyinfection caused by Up, Uu, Mg and Mh can be detected by nested PCR quickly, sensitively and accurately, and it is important to diagnose clinical infective urethritis early.
Keyword: Nested polymerase chain reaction; Infective mycoplasma; Genitourinary tract

支原体是人类泌尿道常见寄生菌之一, 在正常情况下不致于对人体造成伤害, 在特定条件下可以致病, 如滥用抗菌药物造成菌群失调, 使得支原体大量繁殖。支原体在自然界分布广泛, 迄今已分离到150多种, 从人体分离出的有15种[1]。目前认为与人体泌尿生殖道疾病密切相关的有4种, 即微小脲原体(Ureaplasma parvum, Up)、解脲脲原体(Ureaplasma, Uu)、人型支原体(Mycoplasmal hominis, Mh)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg) [2, 3]。目前支原体检测的方法主要有病原培养法和血清学方法, 但灵敏度或特异度都不高, 聚合酶链反应(PCR)具有高通量、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点, 本研究采用巢式PCR技术检测泌尿生殖道致病性支原体, 对1份生物样品同时检测出多种致病性支原体, 避免了误诊、漏诊率, 提高了诊治效率。

材料和方法
一、研究对象

2009年8至2010年2月在台州市第一人民医院皮肤性病科、泌尿外科、妇产科门诊就诊者, 疑为泌尿生殖道感染的患者72例, 分别进行了Up、Uu、Mh和Mg检测, 其中男40例, 女32例, 年龄16~58岁, 平均年龄32.6± 16.8岁。

二、主要仪器与试剂

美国ABI公司的ABI PARISM 7000型全自动荧光定量扩增PCR仪; PCR反应试剂盒购自大连宝生物有限公司。

三、标本采集与保存

1. 标本采集 在用药前或停药1周后采集标本。男性患者:先清洁尿道口, 将棉拭子伸入尿道1~2 cm, 轻轻旋转3~5次捻取分泌物, 将取样后的棉拭子插入配套的备有1 mL无菌生理盐水试管中, 盖紧管盖, 立即送检。女性患者:采样前3 d内未使用阴道内药物或冲洗阴道, 24 h内无性行为, 避开月经期采集; 采集时先用消毒棉签擦去宫颈口过多的分泌物, 再将消毒棉拭子插入宫颈1~2 cm, 轻轻旋转3~5周, 停留10~20 s取样, 以保证获得较多的柱状上皮标本。将取样后的棉拭子插入配套的备有1 mL无菌生理盐水试管中, 盖紧管盖, 立即送检。

2. 标本保存 采集样品2~8℃保存不超过24 h, -20℃保存不超过30 d, 避免反复冻融。

四、引物与探针

采用文献报道中最常见的4种泌尿生殖道致病性支原体[2, 3]及NCBI的GenBank数据库(AF073457、AF073450、AY466443、M96660)中支原体16S~23S DNA序列, 用DNAStar5.0软件进行多序列比对, 对各支原体进行同源性分析比对后设计出两对通用引物, 引物由上海生工合成, 序列为:引物1(5'TGTGATAGCGGTTAAATGCGT AGT3'); 引物2(5'GTGGAGCAAATAGATTAGATA CC3'); 引物3(5'TTGTCGTCAGGTCGTATCGTG 3') ; 引物4(5'GTCCCGTCAACTGAGCGCAAC3')。

五、 参考菌株来源

标准株由南京铁道医学院赵季文教授惠赠(Up:ATCC27813; Uu:ATCC27814; MgATCC33530; Mh:为临床分离株, 经法国生物梅里埃公司鉴定证实)

六、巢式PCR

首轮PCR反应条件为95℃预变性5 min, 94℃变性45s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 35个循环。巢式PCR反应条件为94℃变性45 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 共35个循环。扩增产物理论大小为300bp左右。

七、琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物

取5 μ L扩增产物以2%的琼脂糖凝胶电泳, 经溴化乙锭染色后紫外灯下观察结果。300bp处出现明显条带为阳性。

八、质量监控

每次反应严格设阳性与阴性对照, 避免假阳性和假阴性。

九、测序及型别鉴定

上述扩增产物经API PRISM 310型DNA自动测序仪上进行测序, 测序引物(5'TTGTCGTCA GGTCGTATCGTG3')。测序结果与GenBank数据库进行DNA同源性比较以鉴别不同型别支原体。

结 果
一、 一步法PCR扩增结果

我们检测了72例样本, 抽提DNA 经支原体引物1、引物 2扩增, 其中阳性54例, 阳性率75.0%, 见图1。

图1 一步法PCR扩增各支原体16SrRNA基因结果

二、巢式PCR扩增结果

用引物3、引物4扩增上述扩增产物, 产物长度约为300bp, 取5μ L扩增产物以2%的琼脂糖凝胶电泳, 结果Up、Uu、Mh和Mg参考株均扩增出300bp基因片断, 见图2。72例泌尿生殖道感染的患者经PCR扩增, 其中阳性65例, 阳性率90.3%, 与一步法PCR扩增阳性率75.0%相比, 差异有统计学意义(χ 2=5.857, P< 0.05), 见表1。

图2 巢式PCR扩增各支原体16SrRNA基因结果

表1 巢式PCR与一步法PCR检测结果比较 (n)
三、测序及型别鉴定结果

测序结果与GenBank数据库进行DNA同源性比较结果如下:65例泌尿生殖道感染的患者中Uu感染30例, Up感染14例, Mh感染12例, Mg感染9例。

讨 论

支原体是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性, 能通过除菌滤器, 在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。众所周知沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)是引起非淋菌性尿道炎(nongonococca urethritisl, NGU)的主要病原体, 但其中支原体的致病作用也不容忽视。有研究发现在非Ct感染的NGU患者中, 45.7%有支原体检出阳性[4], 国内有报道称NGU患者中支原体的感染率甚至高于Ct[5] 。Maeda等[6]报道日本男性NGU患者Mg、Uu、Up、Mh的感染率分别为23.8%、18.8%、8.8%、2.6%, 并认为Mg与Uu为NGU持续感染及再复发的主要病原体。支原体体外生长缓慢, 其中生长最快的Uu作选择性培养也需 1周时间, 而生长最慢的Mg则需2~3个月甚至更长的时间, 因此支原体培养不适宜临床的早期快速诊断。利用血清学方法检测各支原体抗体, 则属间接指标, 且支原体属内种类繁多, 不同种的支原体存在交叉免疫反应(如肺炎支原体mycoplasmal pneumoniae 与Mg), 有些支原体同种不同株抗原间也存在异质性(如Mh)且诊断标准与时间难以掌握, 检测非特异性较高, 也不适合临床广泛应用[7]。

巢式PCR运用核酸分子杂交的原理, 具有高通量、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、造价低、污染少等特点。因此可能解决支原体培养和血清学方法检测的问题, 对1份生物样品可同时检测4种病原体, 即Up、Uu、Mg、Mh进行检测, 通过1次试验可筛查上述4种病原体的感染, 且可以用于混合感染的标本的检测, 必将降低我国性传播性疾病的误诊、漏诊率, 提高诊治效率, 做到早期诊断, 及时治疗, 同时也为流行病学研究提供一个新的有效手段。因此巢式PCR技术在致病性支原体的研究中具有广泛的应用前景。曹军等[8]对肾癌组织标本中的支原体感染情况进行了检测, 结果发现免疫组织化学检测和巢式PCR 检测阳性的检出率分别为64.2% 和81.1%, 提示2种检测方法相比较, 巢式PCR是一种较免疫组织化学敏感度更高的检测方法。国外对支原体诊断的研究中研究较早的是日本的Takashi [9], 采用PCR扩增及系统进化分析法对13种支原体和两群Uu进行鉴定, 由于不同支原体和Uu间的亚克隆化及序列的差异, 使得该方法的特异性不高。在此基础上随后又研制了PCR-微量滴定板杂交的方法, 对泌尿道的Up、Uu、Mg、Mh进行检测, 探讨这些病原体与NGU及其他泌尿生殖道感染的关系并确定这些病原体的当前流行状况[10]。本研究选择4种支原体16SrRNA基因, 在GeneBank中获取Up(4个血清型)、Uu(10个血清型)、Mg及Mh相关序列, 同源性分析发现四者在16SrRNA基因区进化中存在差异, 证明该区可用于分群分型研究。从临床样品的检测结果看, 巢式PCR检测的阳性率为90.2%, 一步PCR检测的阳性率为75.0%, 差异有统计学意义(χ 2=5.857, P< 0.05)。一步PCR检测方法由于受到灵敏度的限制, 极易造成漏检。因此, 本研究建立的巢式PCR方法更适宜于泌尿道Up、Uu、Mg、Mh的检测, 特别是对感染早期和中期的检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[10] Maeda S, Deguchi T, Ishiko H, et al. Detection of mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, ureaplasma parvum(biovar 1) and ureaplasma urealyticum (biovar 2) in patients with non-gonococcal urethritis using polymerase chain reaction-microtiter plate hybridization[J]. Int J Urol, 2004, 11(9): 750-754. [本文引用:1]