引用本文
赵琪, 黄学文, 罗瑞华, 黄丽丽, 安仙园, 赵兰静. 液体培养中起始接种浓度对幽门螺杆菌产量的影响[J].检验医学, 2015,25(11): 869-871
ZHAO Qi, HUANG Xuewen, LUO Ruihua, HUANG Lili, AN Xianyuan, ZHAO Lanjing. The influence of the initial inoculated concentration on the product of Helicobacter pylori in liquid culture [J]. Labratory Medicine, 2015,25(11): 869-871  
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液体培养中起始接种浓度对幽门螺杆菌产量的影响
赵琪1, 黄学文2, 罗瑞华3, 黄丽丽2, 安仙园2, 赵兰静2
1. 无锡市人民医院检验科,江苏 无锡 214123
2. 华东疗养院检验科,江苏 无锡 214065
3. 华东疗养院胃镜室,江苏 无锡 214065

作者简介:赵 琪,女,1971年生,学士,副主任技师,主要从事微生物检验研究。

通讯作者:黄学文,联系电话:0510-85350324。

基金:上海市科委医学领域引导科技攻关项目(08411968100)
摘要
目的 探讨液体培养中起始接种浓度对幽门螺杆菌(Hp)产量的影响。方法 心脑浸液液体培养基中加入不同浓度的Hp,每12小时用比浊法测定细菌浓度。结果 不同起始接种浓度的Hp培养物均在24 h达到最大浓度;在104~107 cfu /mL范围内,Hp起始接种浓度与终浓度呈正相关( P<0.01),<104 cfu/mL起始接种浓度的Hp培养物生长不明显,而108 cfu /mL起始接种浓度的培养物终浓度仅发生轻微增加。结论 不同起始接种浓度有不同的Hp产量,在一定范围内起始接种浓度与Hp产量有关。
关键词: 幽门螺杆菌; 液体培养; 起始接种浓度; 产量
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)11-0869-03
The influence of the initial inoculated concentration on the product of Helicobacter pylori in liquid culture
ZHAO Qi1, HUANG Xuewen2, LUO Ruihua3, HUANG Lili2, AN Xianyuan2, ZHAO Lanjing2
1. Department of Clinical Laboratory, Wuxi People's Hospital, Jiangsu Wuxi 214123,China
2. Department of Clinical Laboratory, Huadong Sanatorium, Jiangsu Wuxi 214065,China
3. Room of Gastroscope, Huadong Sanatorium, Jiangsu Wuxi 214065,China
Abstract
Objective To investigate the influence of the initial inoculated concentration on the product of Helicobacter pylori(Hp) in liquid culture.Methods Different concentrations of Hp were added to heart-brain infusion broth, and the concentrations of Hp were detected by the turbidity method every 12 h interval.Results All of the terminal concentrations achieved maximum at 24 h in the liquid culture inoculated with different initial concentrations of Hp. In the range of 104-107cfu/mL, the initial inoculated concentrations of Hp were positively correlated with the terminal concentrations( P<0.01). The cultures inoculated with <104 cfu/mL Hp had not obvious growth,and the terminal concentrations of the cultures inoculated with 108 cfu/mL Hp only increased slightly.Conclusions Different initial inoculated concentrations harvest different product of Hp. In a certain range, the initial inoculated concentrations are positively correlated with the product of Hp.
Keyword: Helicobacter pylori; Liquid culture; Initial inoculated concentration; Product

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp) 是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因, 与胃癌的发生密切相关[1]。近几年, Hp的疫苗已成为研究的热点, 而各种毒力因子、菌体成分及免疫原的制备均需要通过液体培养Hp来获得, 但Hp液体培养的产量问题一直未得到彻底解决。液体培养的影响因素较多, 如气体条件、振摇转速、 瓶子的形状和装量、培养基成分、菌株类型、培养基起始pH值等, 但以上因素不能根本解释Hp液体培养产量低的问题[2]。本研究探讨在相同的培养条件下, 液体培养中起始接种浓度对Hp产量的影响。

材料和方法
一、菌株

NCTC Hp11638(CagA+, VacA+)由上海交通大学医学院病原生物教研室惠赠, Hp0406(CagA+, VacA+)临床株为本室分离。2株Hp经革兰染色、触酶、氧化酶、脲酶鉴定后, -80 ℃保存。

二、试剂及材料

心脑浸液固体培养基、心脑浸液液体培养基和Hp选择剂购自Oxoid公司, 配制按Oxoid说明书进行。混合气体(5% O2, 10% CO2, 85% N2)购自上海神开公司。

三、Hp固体培养及收集

将NCTC Hp11638和Hp0406接种于含7%脱纤维羊血和Hp选择剂的心脑浸液固体培养基, 微需氧条件下(5%O2, 10%CO2, 85%N2), 37 ℃培养3 d。用2 mL液体培养基(pH值7.4)洗脱平板, 收集洗脱液, 于4 ℃ 5 000 r/min(离心半径为8 cm)离心30 min, 弃上清。细菌沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次, 用5 mL心脑浸液液体培养基调节细菌浓度。

四、Hp计数

以心脑浸液液体培养基作为空白对照, 于550 nm处测定吸光度(A)值。根据麦氏比浊推算细菌浓度的方法, 将浊度为0.5的Hp浓度定为108 cfu/mL, 其余Hp浓度按倍比稀释获得。

五、Hp液体培养

5 mL NCTC Hp11638和Hp0406的2株Hp悬液接种于45 mL pH值7.4的含10%胎牛血清和Hp选择剂的心脑浸液液体培养基中(起始接种浓度为102、103、104、105、106、107、108 cfu/mL), 微需氧条件下37 ℃ 200 r/min(离心半径8 cm)振荡培养72 h, 每12小时550 nm测定A值, 同时换气。

六、统计学方法

采用SAS 11.0软件进行统计学分析, 计量数据之间的相关性分析采用线性相关检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、 Hp的鉴定及形状

NCTC Hp11638和Hp0406液体培养后经鉴定为触酶、氧化酶、脲酶阳性的革兰阴性杆菌, 形状呈螺杆状, 偶见长条细丝状。见图1。

图1 Hp液体培养24 h后的革兰染色形态(400× )

二、起始接种浓度对Hp生长的影响

起始接种浓度为102、103、104、105、106、107、108 cfu/mL的NCTC Hp11638和Hp0406液体培养72 h, 每12小时于550 nm测定A值, 结果见表1。

表1 2株Hp不同起始接种浓度的培养物培养后的最大终浓度比较

起始接种浓度为102、103 cfu/mL的2株Hp在培养过程中浓度变化不明显, 其余浓度的Hp均在培养24 h 后达到最大终浓度, 见图2。起始浓度为108 cfu/mL的2种Hp培养物的最大终浓度与起始接种浓度相比增加程度较少(仅2倍多)。与起始浓度为107 cfu /mL的Hp培养物相比, 108 cfu /mL的最大终浓度增加不明显。在104~107 cfu /mL范围内, NCTC Hp11638和Hp0406的起始浓度均与最大终浓度呈正相关(r=0.957、0.970, P< 0.01)。见图3。

图2 不同起始接种浓度的Hp培养物终浓度与培养时间的关系

图3 起始接种浓度与最大终浓度的关系

三、临床菌株与标准菌株的生长比较

有文献报道, 不同菌株的生长曲线不同, 临床菌株与标准菌株的复苏能力有差异[3]。因此本研究选择了临床分离株Hp0406和标准菌株NCTC Hp11638进行生长比较。结果显示, Hp0406与NCTC Hp11638在生长特性和各种起始接种浓度的最大终浓度方面几乎无差异。见表1、图2。

讨 论

Hp是微需氧的革兰阴性杆菌, 在液体培养基中Hp生长有许多自身特性, 并且影响因素众多。迄今为止, Hp的液体培养仍存在许多问题, 其生长特点并未完全清楚[2]。在Hp生长研究中, 我们发现起始接种浓度是影响Hp生长的重要因素。不同起始接种浓度决定着Hp的最终产量, 在104~107 cfu/mL的接种范围内, 接种量越大, Hp的最终产量越大, 并且起始浓度与最大终浓度呈正相关。但Hp的终浓度最大只能达108 cfu/mL左右, 随着起始接种浓度进一步增加, Hp产量增加并不明显。在初始接种量较大时, 本结果与国内的报道基本一致[4, 5]。但在初始接种量较少时, 本结果与童文德等[4]的报道不一致。童文德等[4]报道初始接种浓度为103 cfu/mL时, Hp于36 h后获得较高浓度的菌量。而本研究认为, 起始接种浓度为102、103 cfu/mL的Hp在培养72 h后Hp生长不明显。究其原因, 可能是Hp在体外高浓度培养时对微需氧要求并不高, 而在低浓度时Hp表现为一种氧敏感的微需氧细菌, 目前培养条件不能满足Hp低浓度生长的要求[6]。

有报道认为, 液体培养基中不同的接种浓度有着不同的生长曲线, 接种量越大, 最大生长量所需的时间越短[4, 5]。而本研究结果显示, 到达最大生长量所需的时间与接种量无关, 起始接种浓度> 104 cfu/mL的所有培养均在24 h达到最大终浓度, 继续培养并不能提高Hp产量。这可能与研究所使用菌株的复苏能力有关, 因为随着培养时间的增长, 在所有培养基中螺旋形的Hp都会发生球形变, 具有B型球形变的Hp具有很好的培养复苏能力[3]。

有文献报道, 不同Hp菌株在不同培养基上表现出相当大的生长差异, 标准菌株比临床菌株强壮, 标准菌株较易生长而临床菌株生长需要更长的时间[7]。但本研究结果表明, 临床菌株与标准菌株在生长能力上并无明显差异, 这可能与临床菌株多次传代后生长能力增强有关。

总之, Hp的起始接种浓度直接影响Hp的产量, 在一定范围内Hp的起始接种浓度与Hp产量呈正相关。低浓度的起始接种量不利于Hp生长, 太高的起始接种浓度也不能明显提高Hp产量。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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