引用本文
吴炯, 郭玮, 潘柏申. DNA甲基化检测方法的进展[J].检验医学, 2015,25(10): 822-825
[J]. Labratory Medicine, 2015,25(10): 822-825  
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DNA甲基化检测方法的进展
吴炯, 郭玮, 潘柏申
上海复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032

作者简介:吴 炯,男,1977年生,学士,主管技师,主要从事临床生化工作。

摘要
关键词: 甲基化检测; 甲基化分型; 甲基化组学
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)10-0822-04

DNA甲基化是重要的表观遗传学改变之一, 肿瘤细胞中DNA甲基化形式包括基因组的整体水平低甲基化及特定基因的高甲基化。尤其是抑癌基因启动子区的高甲基化, 可直接阻碍转录因子与启动子结合, 从而使抑癌基因不能转录或转录水平降低。因此, 基因启动子的异常甲基化可作为候选的肿瘤标志物。大量研究通过对肿瘤患者血清及其他体液中的凋亡肿瘤细胞的DNA甲基化检测辅助诊断肿瘤及判断预后, 包括乳腺癌患者的乳头抽吸物, 肺痛患者痰及支气管灌洗液, 前列腺癌患者的尿液及其他多种肿瘤患者的血浆及血清[1]。

甲基化检测方法分为两类[2], 甲基化分型(methylation typing)和甲基化图谱(methylation profiling), 后者又被称为甲基化组学(methylome)。甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测, 多为单基因的甲基化检测。甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。

一、甲基化分型

绝大多数的DNA甲基化分型均基于聚合酶链反应(PCR)的方法 , 使用亚硫酸氢钠处理过的DNA作为模板。PCR引物设计上通常存在2种策略:甲基化非依赖性PCR(methylation-independent PCR, MIP)引物:甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)引物。

1. 亚硫酸氢钠处理 DNA聚合酶无法区分甲基化及非甲基化的胞嘧啶, 故普通PCR过程会导致表观遗传学信息的丢失。1992年Frommer等[3]首次报道了基于亚硫酸氢钠处理的方法, 并被广泛使用, 成为PCR法检测单位点DNA甲基化的重要基础。经亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶可转化为尿嘧啶, 而甲基化后的5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为胸腺嘧啶的几率大大降低。由此亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶只来自于5-甲基胞嘧啶, 而尿嘧啶残基被当作胸腺嘧啶复制, 通过这种方式可有效保留DNA的甲基化信息。

2. MIP引物 MIP引物设计位于需检测的甲基化位点两侧, 同时成比例的扩增甲基化及未甲基化的部分。为解决PCR偏倚, Wojdacz等 [4] 报道在MlP引物中引入有限的CpG位点, 并通过控制退火温度来有效控制PCR偏倚; Shen L等[5]报道仅通过提升退火温度即足以抵消PCR偏倚; Chhibber等[6]报道通过单DNA分子的PCR可克服PCR偏倚的现象。

亚硫酸氢盐基因测序:亚硫酸氢盐修饰PCR扩增后的DNA测序, 传统上被认为是DNA甲基化分析的金标准。Weisenberger等[7]报道了一种数字化亚硫酸氢盐基因测序法, 可对单分子进行测序而无需挑克隆。该方法通过样本稀释至标准水平, 尽可能将反应中模板分子减至最小。并通过同一样本的多重反应(每个样本至少进行96个反应), 将数字化分析后合理阳性样本进行测序, 极大的节约了时间及精力。

焦磷酸法测序:通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶及反应底物5'磷酰硫酸、荧光素的酶级联反应, 使得每一个dNTP的聚合酶与一次荧光信号的释放偶联, 可极大提高检测的敏感性。但焦磷酸测序的准确性受制于片段长度, CpG与前向引物3'端的距离也可影响检测结果的准确性。

结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析:使用限制性酶消化PCR产物后区分甲基化和未甲基化的DNA。用亚硫酸盐修饰后, 甲基化和未甲基化的DNA测序的差异可以导致新的甲基化依赖的限制性位点的产生, Xiong等[8]发展的“ 联合亚硫酸盐限制性分析” 通过将琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳产物消化后杂交分析, 可定量检测甲基化位点。

甲基化敏感性单核苷酸引物延伸MEIHYLA-TION— SENSITIVE SINGLE— NUCLEOTIDE PRIMER EXTENSION(MS-SnuPE):单核苷酸引物延伸技术最初用于单核苷酸突变分析, Gonzalgo等[9]将其发展后应用于DNA的甲基化研究。首先应用MIP引物扩增所需检测序列, 凝胶产物分离后退火加入内部引物。内部引物在DNA聚合酶的作用下聚合32P标记的dCTP或者dTTP延伸, 产物可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

甲基化敏感熔解曲线分析:亚硫酸盐处理后获得的甲基化与未甲基化DNA间序列的差异, 可通过熔解曲线分析技术发现, 因为甲基化DNA含有更多的GC相对更难熔解。甲基化分析时可通过熔解温度及峰型的变化轻易的区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。近年高分辨率熔解(high resolution melting, HRM)技术的发展带来了应用上的优势[10], HRM方法熔解曲线更光滑, 可检出更微小的区别。HRM方法可检测传统的MIP引物, 也可以在MIP引物中引入少量的CpG位点来修正PCR偏倚并提高分析敏感性。MIP加入CpG位点的方法可将PCR偏倚推向甲基化一侧, 并通过退火温度的控制可明显提升分析敏感性[11]。

碱基特异性裂解和引物延伸的MALDI-TOF质谱测定:在MIP引物的基础上引入MALDI-TOF质谱法分析产物, 其敏感性较高, 可准确检出5%的甲基化, 适用于高通量样本[12]。但由于其需要昂贵的设备, 方法具有复杂性, 限制了其临床应用。

重甲基法:Cottrell等[13]报道了MIP引物基础的定量甲基化检测方法, 将之命名为重甲基法(HEAVYMETHYL)。首先在MIP引物基础上添加了寡核苷酸阻断剂区别甲基和未甲基化等位基因, 阻断剂只识别未甲基化片段。当存在甲基化位点, 寡核苷酸探针无法结合, 引物顺利结合并加以扩增, 而非甲基化位点扩增则受到抑制。重甲基法中阻断剂在每一个PCR循环均提供特异性识别, 所以其假阳性率类似MSP方法, 并具有高通量、闭管的特点。

3. 甲基化特异性PCR引物 MSP引物是指在引物设计中包括入甲基化位点, 扩增时只扩增甲基化DNA, 避免了MIP引物带来的PCR偏倚的现象。MSP引物随着循环数的增加可以带来极高的敏感性, 但通常伴随着相当高的假阳性率[14]。假引物事件(引物序列与模版不匹配但依然扩增)及未完全亚硫酸氢钠转化都会引发假阳性的结果。

甲基化特异性PCR:是最为经济实用的方法, 无需特殊仪器, 是目前应用最为广泛的方法。传统的MSP方法中, 通常设计第2套引物用于扩增未甲基化片段, 并与MSP引物同时扩增经亚硫酸氢钠处理的DNA模版, 扩增后通过凝胶电泳比较条带强度来估算甲基化水平。MSP方法有极高的成本效益比, 但前提是避免假阳性的结果, 此外PCR反应管应尽可能避免被打开以防止污染。

定量甲基化特异性PCR:使用荧光水解探针, 在MSP扩增同时检测荧光强度, 使得定量检测甲基化成为可能[16]。这一技术被命名为methylight, 克服了大多数MSP存在的问题:首先, 只有当探针与引物杂交时, 才会观察到扩增, 从而消除任何非特异性扩增的信号。扩增产物无需进行凝胶分析, 可以闭管大通量进行检测。其次探针序列中添加更多的CpG位点使错启动事件的可能性变得更小, 不完全转化导致的假阳性可被探针序列中的许多非CpG胞嘧啶限制。但探针的引入会增加设计的复杂性, 且探针有可能无法检出杂合甲基化。

SYBR GREEN基础的定量MSP:以荧光染料插入双链DNA为基础的定量MSP方法正逐渐取代探针法。这一方法发端于将SYBR Green I染料用于凝胶电泳分析PCR产物。SMART-MSP(实时MSP之后的敏感的熔解分析)同样基于HRM原理, 通过双链DNA中内插入荧光染料的原理获得实时的荧光信号。实时的MSP反应将CT值进行指数转化后通过与标准浓度的比较可以得到未知基因的定量结果[17]。SMART-MSP继承了HRM方法的高敏感性、高通量、低污染的特点。对假引物引发的假阳性结果是一种适合的解决方法。但不适用于不完全转化引起的假阳性, 可能导致的甲基化水平的估计过高。

定量MSP-甲基化特异性荧光扩增(MS-FLAG):Bonanno等[18]报道的新颖的定量检测甲基化的方法, 热稳定的PspGI核酸内切酶切割MSP引物产生荧光信号。引物寡核苷酸链的5尾端携带荧光染料及淬灭剂, 染料与淬灭剂间被核酸内切酶识别。扩增的甲基化片段数量与荧光信号强度成正比。

二、甲基化图谱

自DNA甲基化被认识以来, 60年中, 人们一直在追求对全基因水平甲基化的分析。随着技术的不断发展, 这一目标正在被逐步实现。

1. 液相色谱法检测基因组甲基化水平 液相色谱法基础的甲基化图谱分析应该被认为是第一代甲基化谱的检测。液相色谱法快速且定量, 与质谱法相连可极大提高其检测敏感性, 但只能检测总的甲基化水平, 无法定位具体基因甲基化情况, 故这一技术始终未被广泛应用。

2. 凝胶基础的甲基化图谱分析 1991年发展的限制性酶切路标基因扫描(restriction landmark genomic scanning, RLGS)技术是此类的代表[19]。通过使用甲基化敏感的内切酶, 优先对特定区域进行酶切(CpG岛), 并通过二维电泳的方式对产物进行分析, 可显著提高对潜在位点的分析能力。可实现了对全基因范围的甲基化谱的分析, 并可定位具体甲基化位点。

3. 阵列基础的甲基化图谱分析 九十年代中期阵列技术的发展是功能化基因组学革命的重要推动力之一, 这一技术的进步为甲基化图谱的分析打开了一扇大门。阵列分析基础的甲基化检测技术发展于2002年, 本质上这一方法包含传统的亚硫酸盐处理, 并于之后进行PCR扩增, 扩增片段长度在300至400bp左右。产物与预设的微阵列相结合, 区分转化及未转化的CpG, 可以将甲基化位点加以区分。这一方法可对位点甲基化进行分析, 但重亚硫酸的转化简化了序列的复杂性, PCR过程中的偏倚也会对结果产生影响, 且阵列技术本身限制了其对全基因组的甲基化情况进行分析, 设计足够多的探针以覆盖基因组范围依然是一项挑战。商业化的芯片如Illumina的新一代Beadarray分析的可同时检测~28 000 CpG点, 但这依然只占了人类基因甲基化位点的0.1%(总数约2 800万)。

4. 测序基础的甲基化图谱分析 测序法的方法基础依然是MIP引物结合sanger测序, 人类基因组计划带来了测序革命性的变化。这一变化催生了全基因组的测序基础的甲基化分析。第一代的甲基化测序技术通过亚硫酸处理模版, PCR扩增小片段并进行10至20个克隆并进行测序。这一技术关键在于ESME算法的应用, 通过这一算法可将直接PCR产物测序结果计算甲基化值并调整亚硫酸处理导致的不完全转化因素, 从而把测序结果组转化为长片段的甲基化测序结果。Eckhardt等[20]于2006年使用这一技术成功地对12种不同组织中的3条人类染色体进行了全甲基化谱的分析。产生了近200万个CpG甲基化信息, 揭示了不同组织中表观遗传学的差异。简化表达亚硫酸盐测序(reduced representation bisulphate sequencing, RRBS)是另一类的甲基化测序方法, 将限制性长度选择、亚硫酸氢盐转化、PCR扩增及挑克隆技术相结合[21]。这一技术被成功应用于鼠胚胎干细胞去甲基转移酶前后的甲基化谱的检测。目前罗氏公司的GSFL-X测序仪, Illumina的1G基因测序仪及Applied Biosystems的SOLID测序仪已能实现这一功能, 新一代的平台通量更大、费用更低, 然而由于测序片段更小需要更为复杂的计算机软件完成结果的综合及输出。

在诸多的表观遗传学标志物中DNA甲基化越来越受到重视, Cottrell[22]总结甲基化标志物的优点在于:首先DNA是稳定的分子能够轻易地自体液及组织中得以分离, 而RNA需要逆转录PCR分析; 其二无论是福尔马林固定或石蜡包被的组织都可用来检测DNA甲基化; 其三甲基化信号检测为阳性, 检测上存在优势。但甲基化标志物应用于临床依然有无数的工作需要进行, 其焦点在于缺乏诊断敏感性和特异性, 这一缺乏原因来源多样包括上述检测技术中的原因, 需要更多的研究加以关注。总之, DNA甲基化是一项充满希望的标志物, 但在真正应用于临床之前依然有着较长的探索之路。

The authors have declared that no competing interests exist.

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